Микробные биопленки как объект изучения в научно-исследовательской работе учащихся

Ключевые слова: биопленка, иммобилизованные клетки, экзополисахаридный матрикс, научно-исследовательская работа.

На современном этапе развития школьного образования первостепенной задачей ставится индивидуальный подход к учащимся. Исследовательская работа школьников является одной из возможных способов реализации этого подхода. Многие учителя в своей работе системно используют исследовательскую работу со школьниками и добиваются хороших результатов.

Для осуществления исследований, учителю необходимо создать условия, подходящие именно для данного конкретного обучающегося или группы обучающихся. В результате учителю приходится ответить на множество вопросов:

                   Что такое исследовательская работа школьника, в чем ее специфика и особенности

                   В чем польза выполнения такой работы для учащихся

                   Как заинтересовать детей и администрацию школы этим направлением

                   Как вписать выполнение работы в школьное расписание

                   Какую выбрать тему и объект исследования?

Одним из интересных объектов исследования могут быть микробные биопленки. При изучении школьного курса биологии, обучающиеся узнают о существовании микроорганизмов еще в 5 или 6 классе (в зависимости от УМК).

Изначально рассматриваются вопросы строения микробной клетки, среды жизни микроорганизмов, роль микроорганизмов в природе и жизни человека. Но практически не рассматриваются вопросы связанные со взаимодействием микроорганизмов друг с другом. У учащихся складывается впечатление, что микроорганизмы живут сами по себе, и не зависят друг от друга. Для решения данной проблемы, мы предлагаем использовать микробные биопленки в качестве объекта для научно-исследовательской работы.

Еще в 17 веке А.ван Лёвенгук используя свои простые микроскопы, впервые наблюдал микроорганизмы зубного налета [8], он увидел, что микроорганизмы взаимодействуют друг с другом, активно конкурируют, или даже поедают друг друга. Такое взаимодействие напомнило Лёвенгуку поведение диких животных, но поскольку микроорганизмы были маленкими, то Лёвенгук и назвал их «анималькуле», то есть «зверушки». По-сути, Лёвенгуку первому удалось изучить сообщество микроорганизмов не только эукариотических, но и прокариотических.

Прокариоты в природе существуют в двух физиологических формах, которые реализуют различные стратегии выживания. Свободно живущие популяции микроорганизмов с интенсивными клеточным делением и развитыми системами активной и пассивной подвижности, быстро распространяются в среде, относятся к планктонным формам. «Оседлые» сессильные формы (sessile cell) имеют выраженные механизмы специфической адгезии, они характеризуются несколькими периодами роста (см. рис. 1):

Рис. 1. Фазы роста микроорганизмов

1.              Лаг-фаза — фаза задержки роста
2.              Фаза логарифмического (экспоненциального роста)
3.              Фаза замедленного роста
4.              Фаза стационарного роста
5.              Фаза гибели

Вначале быстрой скоростью роста, популяций и способностью агрегироваться в клеточные консорциумы. Популяции сессильных клеток формируют биопленки — сообщество клеток, адгезированных на субстрате, со сложной системой регуляции физиологических процессов, основанной на межклеточной коммуникации. Саму идею о существовании структурированных микробных сообществ, а не свободноплавающих, «планктонных» формах, выдвинул в 1987 г. J. Costerton с соавторами. Они и сформулировали общую теорию существования биопленок, согласно которой, большинство микроорганизмов растут в замкнутых матрицах и биопленках прикрепленных к поверхности каких-либо экосистем, обеспеченных питанием и содержащих воду.

Биопленка — это микробное сообщество, которое характеризуется клетками, прикрепленными к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, а также демонстрирующих изменение фенотипа, выраженного изменением параметров роста и экспрессии специфичных генов.

Биопленки могут развиваться на поверхности раздела различных фаз: жидкой и твердой (вода — твердая фаза), жидкой и газовой (вода-воздух), твердой и газовой (горные и земляные породы, поверхность зданий — атмосфера) [8]. Основные наиболее исследованные виды биопленок, формирующиеся на границе твердой и жидкой фаз, имеют следующие морфотипы:

                   Простой слой клеток, сформированный одним или несколькими видами микроорганизмов

                   Маты фотосинтезирующих, метаногенных и сульфатредуцирующих бактериальных сообществ

                   Зубные биопленки (бляшки), образованные сложным сообществом многих микроорганизмов

                   Пленка с лентами выростами, сформированная смешанной популяцией бактерий в условиях турбулентного потока

                   «грибы» — биопленки сформированные одним или несколькими видами микроорганизмов со специфической трехмерной структурой особыми функционально-морфологическими образованиями

                   Бентосные и речные осадки, а также взвешенные в воде хлопья [7].

Гелеобразная матрица биопленке обогащается питательными веществами, то есть выполняет кумулятивную роль, что является приоритетом в олиготрофных средах. В толще ВПВ значительно ограничен транспорт питательных веществ, что приводит к возникновению концентрационных градиентов в биопленке. Из-за разницы концентраций кислорода на поверхности биопленки и в ее толще, может возникать деление на аэробную и анаэробную зоны [8]. Возникновение зон в структуре биопленки позволяет иммобилизованным микроорганизмам использовать многие неорганические и органические субстраты [5, 8, 9].

Образование биопленок является одной из стратегий выживания бактерий в окружающей среде [6]. Для примера, можно указать, что в 1973 году Caracklis изучал микробные штаммы в промышленных системах водоснабжения и показал, что они обладали высокой устойчивостью к дезинфицирующим средствам.

Основным структурным компонентом биопленки является полисахаридный матрикс матрикс, он же ВПВ, он же экзополимер [8, 10,]. На его долю приходится 85 % от всей биопленки. Химический состав матрикса не одинаков у разных систематических групп [12,13, 15] микроорганизмов, но как правило, у всех матрикс представляет собой анионный полимер [10]. Он содержит полисахариды (декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу, и другие), эта фракция наиболее выражена и составляет от 40 до 95 %. Содержание иных химических компонентов может сильно варьировать. Так на долю белков может доходить до 60 %, липидов до 40 %, нуклеиновых кислот от 1 до 20 %. Эти соединения находятся в гидратированном состоянии, так как 80–90 % объема биопленки занимает вода.

Матрикс биопленки разделен каналами, наполненными водой, а также имеет полости и пустоты. Через каналы транспортируются питательные вещества и проходят конвективные потоки кислорода от внешних к внутренним частям биопленки, одновременно с этим выводятся метаболиты бактериальных клеток [13].

Клетки бактерий в биопленке имеют сложную полиморфную организацию с определенной цитоархитектоникой (выявляются клетки с сильно измененной морфологией, мертвые клетки, различные удлиненные типы у кокковых форм и т. д. Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболитической кооперации клеток внутри пространственно хорошо организованных систем, создает условия, благоприятствующие установлению симбиотических взаимоотношений между бактериями разных видов [6].

Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток для колонизации в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации. «Quorum sensing» (QS) или чувство кворума — это процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток [2, 4].

Благодаря QS-регуляции, бактерии имеют возможность координировать и контролировать экспрессию тех или иных генов во всем сообществе, а это способствует адаптации всего микробного сообщества в меняющихся условиях среды, что позволяет сохранять свою экологическую нишу и выживать в неблагоприятных условиях.

Способность биопленок переживать неблагоприятные условия, а также противостоять действию токсикантов создает массу проблем в промышленности. Это биокоррозия промышленных установок, образование биопленок на поверхностях протезов, имплантатов, катетеров [4] и т. д.

Ассоциации, аналогичные биопленкам, создаются во многих биотехнологических процессах: при биоремедиации почв, при микробном выщелачивании металлов из руд, в процессе очистки сточных вод и во многих других случаях.

Микробные биопленки — очень удобный объект для исследования. Во-первых, их просто получить (об этом будет рассказано ниже), во-вторых — открываются широкие возможности для микроскопии, в-третьих, обучающиеся при изучении биопленок знакомятся с различными формами микроорганизмов, как эукариот, так и прокариот.

Методы исследования:

Получение биопленок

Данную работу мы предлагаем выполнить по методике стекол обрастания. Хорошо обезжиренные предметные стекла привязываем по одному на леску и леску со стеклами помещаем в какой-либо водоем (или аквариум) сроком не менее чем на 10 суток. Одну сторону стекла целесообразно заклеить скотчем. После извлечения стекла обрастания, скотч снимается. Данный прием поможет избежать обрастания оборотной стороны стекла, и микроскопировать такой препарат будет легче.

Фиксация биопленок:

Так как биопленки полученные нами на стеклах обрастания будут содержать в своем составе водоросли, фиксацию целесообразно проводить в смеси Темпера или смеси Аммана.

Смесь Темпера: Смесь Аммана

                   хлорная медь — 0,2 г -лактофенол — 50 мл

                   азотнокислая медь — 0,2 г — вода — 95

                   фенол — 1 г — хлорная медь — 2 г

                   вода — 99 мл — уксуснокислая медь — 2 г

При фиксации растворами, содержащими соли меди, следует учитывать, что действуют они довольно медленно, поэтому материал следует выдерживать в них в течение 1 недели.

Со стекол необходимо снять скотч, и поместить стекла в склянку с фиксирующей жидкостью. В ней же можно стекла хранить продолжительное время.

Микроскопия биопленок:

а)               Учет количества иммобилизованных микроорганизмов

Для учета микроорганизмов использовали бальную систему:

Подсчет ведут в 10 полях зрения, суммируют результат. Далее определяют общее число учитывая площадь всего предметного стекла

б)               Определение наличия Внеклеточного полисахаридного матрикса

Внеклеточный полимерный матрикс синтезируется клетками биопленки, и обеспечивает в первую очередь защиту клеткам. В основном внеклеточный полимерный матрикс состоит из каллозы. Данный углевод при гидролизе дает глюкозу. Каллоза представляет собой бесцветное, аморфное, сильно преломляющее свет вещество. Не растворяется в холодной воде, спирте и реактиве Швейцера. Легко растворяется в крепких соляной кислоте и серной кислоте, растворах хлористого кальция и хлористого цинка, в 1 % — х растворах едкого кали и едкого натра, а также в жавелевой воде. Аммиак и 5 % раствор соды вызывает набухание каллозы без ее растворения.

Для окрашивания используют метиленовый синий. Данный краситель готовят в концентрации 0,005 %. При отсутствии данного красителя, можно использовать лекарственный препарат метиленовый синий, купленный в магазине аквариумных товаров. Препарат необходимо разбавить в соотношении 1:1000 и использовать как краситель. Стекло с биопленокой помещают на 4 часа в раствор красителя, промывают водой и заключают в желатину (для этого 1 г желатины растворяют в 100 мл воды). Высушивают препарат и микроскопируют.

в)               Выявление слизей

Слизями называют вещества, сильно набухающие в воде и образующие с ней вязкие растворы. Для выявления слизей можно воспользоваться их способностью к набуханию. Промытое от фиксирующей жидкости стекло с биопленкой накрывают покровным стеклом. Под него вводят спирт, затем при непрерывном наблюдении в микроскоп, под покровное стекло впускают воду, отсасывая спирт с противоположной стороны фильтровальной бумагой. Слизь при этом набухает. В этом можно убедится, сравнив исследуемый участок биопленки с необработанным участком. Можно провести и цветную реакцию на слизь. Методика была описана М. Н. Прозиной (1960) с сернокислой медью. Срезы помещают в концентрированный раствор медного купороса на 5–10 мин, затем излишки реактива смывают водой и обрабатывают препарат концентрированным раствором щелочи. Далее микроскопируют препарат. Слизь при этом окрашивается в синий цвет (см. рис. 2)

Рис. 2 Выявление слизей в биопленке

г)               Определение белков по Захарису

Данная реакция основана на адсорбции белками железосинеродистого калия (желтой кровяной соли). Стекло с биопленкой промываем от фиксирующей жидкости. Далее помещаем на 1 час в смеси равных объемов 10 %-го раствора желтой кровяной соли, дистиллированной воды и 50 %-й уксусной кислоты. После выдерживания 1 час в реакционной смеси, стекло извлекают, промывают 60 % спиртом и далее слабым раствором хлорного железа (примерно 2 %). В результате данной реакции в белковых образованиях выпадает нерастворимый осадок берлинской лазури (см. рис. 3).

Рис. 3 Определение белков по Захарису

Окраска сохраняется в глицерине долгое время [1].

Выводы:

Существование микроорганизмов в виде биопленок — доказанный факт. В настоящее время в биотехнологии активно используются иммобилизованные микроорганизмы. С целью развития познавательного интереса учащихся к биологии и углубления знаний по микробиологии, а также совершенствовании практических навыков проведения лабораторных работ, для проведения учебных исследований можно использовать микробные биопленки. Подобран комплекс методов исследования биопленок и проведена их микроскопия.

Литература:

1.              Барыкина Р. П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. — М.: Изд-во МГУ, 2004. — 312 с.
2.              Буланцев А. Л., Елизаров В. В. Новые представления об экологии бактериальных популяций с коммуникативной системой сигнализации// Проблемы особо опасных инфекций, вып. 91, 2006, С. 11–12
3.              Владимирова И. В. Экологические аспекты современной биотехнологии // Биология в школе, № 7–2009, С. 11–14
4.              Гостев В. В. Бактериальные биопленки и инфекции// Журнал инфектологии Том 2 № 3–2010
5.              Гребенщикова И. А. Очистка сточной воды гидролизного производства в анаэробных биореакторах и др. // Биотехнология № 4–2002, С. 70–79
6.              Ильина Т. С. и др. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регулирования их развития // Генетика, Т.40 № 11–2004, С. 1445–1456
7.              Николаев Ю. А. Плакунов В. К. Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма // Микробиология, Т. 76 № 2–2007,
8.              Сироткин А. С. Агрегация микроорганизмов: флоккулы биопленки, микробные гранулы. Под.ред. А. С. Сироткина, Г. И. Шагинурова, К. Г. Ипполитов; Аккад. Наук Респ. Татарстан, Казань. ФЭН: Аккад. Наук РТ, 2007–151 с.
9.              Сироткин А. С. и др. Биологическая трансформация соединений азота в процессе биофильтрации сточных вод. // Биотехнология, № 3–2008 с. 77–85
10.         Смирнова Т. А. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок // Микробиология, Т. 79, № 4–2010, С. 435–446
11.         Чернявский В. Н. Бактериальные биопленки и инфекции (лекция)// AnnalsofMechnikovInstitute, № 1–2013. www. iniam.org.ua//journal.htm.
12.         Mohamed J. A. Biofilm formation by enterococci / J. A. Mohamed, D. B. Huang//J. of Med. Microb.- 2006 № 56. P. 1581–1588
13.         Moons P. Bacterial interactions in biofilms/ P. Moons et. al. //Crit. Rev. Microbiol. — № 3- 2009 Vol. 35 P. 157–168
14.         Pace J. L. Biofilms, Infection and Antimicrobial Therapy / ed. Taylor and Francis Group, 2006–495 p.
15.         Xavier J. B. Biofilm — control stragies based on enzimic disruption of the extracellular polymeric substance matrix — a modeling study/ J. B. Xavier, et. al. //Microbiology. — 2005. — № 151 P. 3817–3832