Для правильного и своевременного лечения, для контроля за состоянием пациента необходимы многочисленные методы обследования. Клинические симптомы зачастую не отражают реальной картины заболевания, в таких ситуациях требуется применение лабораторных методов диагностики.
Наиболее распространенными методами лабораторной диагностики являются: микроскопические (идентификация микроорганизмов путем окрашивания специальными красителями с последующей микроскопией), биохимические (определение концентрации белков, соединений, микро- и макроэлементов в сыворотке крови), культуральные (выращивание микроорганизмов на специальных средах), ИФА — иммуноферментный анализ (основанный на определении антигенов возбудителей и антител к ним, позволяющий количественно определить гормоны и другие биологически активные вещества в сыворотке крови), ПЦР — полимеразная цепная реакция — молекулярно-генетический анализ, позволяющий синтезировать строго определенный (видоспецифичный) фрагмент генома возбудителя.
Развитие биотехнологических методов, наряду с разработкой высокоточного лабораторного оборудования позволяют внедрять в лечебно-диагностический процесс ПЦР диагностику.
ПЦР была изобретена в США Керри Б. Мулисом в 1983 году. За данный метод диагностики ученый получил Нобелевскую премию в области химии.
Благодаря международной программе «Геном человека» метод получил особенно бурное развитие.
ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами.
При правильном выполнении всех методик можно с уверенностью заявить, что ПЦР-анализ не дает ложных результатов, в отличии от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими компонентами.
Необычайная чувствительность метода позволяет обнаруживать единичные клетки возбудителя в самых различных биологических тканях — слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток. Полимеразно-цепная реакция основана на обнаружении специфической ДНК или РНК бактерий либо вируса в присутствии миллионов других молекул. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.
Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы имеет огромное значение для эффективного лечения и предотвращения распространения инфекции.
Принцип действия ПЦР состоит в многократном синтезе копий генетического материала вирусов или бактерий в лабораторных условиях. Для понимания этого явления напомним, что основой хранения наследственной информации и основой жизни является ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота. ДНК состоит из двух нитей, которые сформированы из азотистых оснований — нуклеотидов. Нуклеотидов всего четыре. Нуклеотиды обладают свойством комплиментарности, то есть с определенным типом нуклеотида может связаться только определенный тип другого нуклеотида. Например известны нуклеотиды аденин, тимидин, цитозин и гуанин. Из них аденин может связываться с тимидином, а цитозин с гуанином. Но не наоборот. В последовательности нуклеотидов закодирована уникальная для каждого живого организма информация. Будь то человек или вирус. У некоторых вирусов наследственная информация закодирована в другой нуклеиновой кислоте –РНК. Как ДНК, так и РНК являются уникальными для каждого живого организма. Поэтому, идентифицировав ДНК, можно с уверенностью утверждать, что она принадлежит определенному микроорганизму. Упрощенно такой механизм идентификации можно сравнить с отпечатками пальцев. Рисунок линий на пальцах уникален для каждого человека. Нет необходимости видеть портрет. Достаточно просто сверить отпечаток пальца с базой данных. Таким же образом работает и ПЦР. В роли «отпечатка пальца» при диагностике бактериальных или вирусных заболеваний выступает фрагмент ДНК или РНК. Выделив ДНК возбудителя от больного, можно совершенно четко его идентифицировать. Таким образом метод ПЦР основан на идентификации возбудителя по его ДНК или РНК. При этом даже не важно, живой возбудитель или уже нежизнеспособный. Метод ПЦР с одинаковым успехом, в отличие от бактериологического посева, может идентифицировать присутствие возбудителя.
Чувствительность метода ПЦР настолько высока, что теоретически можно обнаружить бактерию или вирус, даже если они находятся в образце в количестве 1 единицы.
Применение метода ПЦР влечебном процессе ГУЗ «СГКБ №10»
С января 2016 года открыта лаборатория ПЦР диагностики, которая является структурным подразделением ГУЗ «Саратовская городская клиническая больница № 10».
Деятельность ПЦР лаборатории осуществляется на основании лицензии на проведение ПЦР диагностики и лицензии на проведение работ с микроорганизмами III-IV группы патогенности.
Работа лаборатории организована в соответствии с нормативными документами:
– Методические указания 1.3.2569–09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности»;
– Методические рекомендации «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР — диагностики»;
– СП 1.2.1318–03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности, генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами»;
– СанПиН 2.1.7.2790–10 «Требования к обращению с медицинскими отходами»;
– Р3.5.1904–04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях».
Полимеразно-цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным методом клинической лабораторной диагностики.
В основе метода ПЦР лежит комплиментарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое in vitro с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы.
Для ПЦР- обследования применяется несколько специально разработанных методик.
Лаборатория ПЦР диагностики ГУЗ «СГКБ № 10» использует самый современный метод — гибридизационно-флуоресцентный (детекция продукта в режиме «реального времени» или регистрация продукта после окончания реакции амплификации). Недавно разработанная технология ПЦР, работающая в режиме реального времени, становится часто используемым в современной медицине. Вирусные инфекции можно выявить сразу после заражения, за некоторое время до того, как проявятся симптомы заболевания.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики скрыто существующих форм микроорганизмов при латентных и хронических инфекциях.
На сегодняшний день лаборатория проводит ПЦР диагностику инфекционных заболеваний:
– исследование крови на цитомегаловирус,
– исследование крови на вирусный гепатит С,
– исследование крови на вирусный гепатит В,
– исследование крови на вирус простого герпеса,
– исследование крови на вирус Эпштейн-Барра,
– исследование отделяемого женских половых органов на уреаплазму, микоплазму, хламидии,
– исследование отделяемого из уретры на микоплазмы, уреаплазму и хламидии,
– исследование отделяемого из цервикального канала на вирус папилломы человека,
– исследование мокроты на микобактерии туберкулеза,
– исследование мазков из ротоглотки, носоглотки на вирус гриппа А/В.
Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. В лабораторной диагностике большинство ошибок совершается на этапе пробоподготовки.
ПЦР — диагностика состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, собственно полимеразной цепной реакции и детекции продукта ПЦР.
Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. Для детекции используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта.
Регистрация флуоресцентного сигнала проводится в процесса амплификации на специальном приборе — амплификаторе. По нарастанию интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору, вычисляется концентрация исходной матрицы ДНК.
Правила получения иподготовки материала для ПЦР-диагностики.
- Осуществлять взятие клинического материала, строго следуя инструкции, только стерильными одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры.
- Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем наборов реагентов (в случаях, где использование транспортной среды является необходимым).
- Сразу после взятия плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.
- При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгиваний и расплескиваний, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей.
- При переносе клинического материала из пробирок, флаконов в новые использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами.
- Строго соблюдать правила хранения и транспортирования клинических проб. Охлаждающие элементы перед транспортированием клинического материала замораживать до необходимой температуры.
Для проведения пробоподготовки используют ПЦР-боксы. Чтобы смешать необходимые для исследований реагенты используют центрифуги и вортексы. Чтобы извлечь реакционную смесь и прочие материалы применяют автоматические дозаторы.
Помещения иоборудование лаборатории ПЦР.
В соответствии с этапами проведения анализа, ПЦР-лаборатория ГУЗ «СГКБ № 10» имеет последовательно расположенные, самостоятельные рабочие зоны:
приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала (рабочая зона 1),
выделения нуклеиновых кислот (рабочая зона 2),
приготовления реакционных смесей (рабочая зона 3),
проведение амплификации нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации (рабочая зона 4).
Рабочие зоны представляют собой боксированные помещения, состоящие из бокса и предбокса, соответствующим образом промаркированы. В рабочей зоне 1 осуществляют прием материала, его маркировку, регистрацию в специальном журнале, первичную подготовку. В рабочей зоне 2 проводят выделение и очистку нуклеиновых кислот микроорганизмов из проб, подготовленных в рабочей зоне 1. В рабочей зоне 3 осуществляют приготовление реакционных смесей, проведение обратной транскрипции.
В рабочей зоне 4 проводят амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации.
Результаты ПЦР анализа на инфекции обычно выглядят как таблица. В первой колонке идут виды возбудителей, определенных в ходе анализа. Во второй результаты.
Таким образом, технология ПЦР обеспечивает возможность изучения и диагностики хронических инфекционных процессов, экологии возбудителей инфекционных заболеваний и открывает новые перспективы в медицинской диагностике.
Литература:
- Патрушев Л. И. «Искусственные генетические системы» — М.:Наука, 2005 – 2 т. — ISBN 5–02–033278-X
- Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1 -4 групп патогенности: Методические указания. — М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009, — с.
