Фагоциты в механизмах адаптации плода и новорожденных



В настоящее время обезболивание родов в системе родовспоможения заняло прочное место и нет признаков того, что оно сдаст свои позиции. Вместе с тем, в последние годы немало фактического материала, свидетельствующего о нарушении ранней адаптации новорожденного к условиям внешней среды при обезболивании родов [1, 18, 19, 3, 4]. В настоящей работе поставлена цель выяснить, как болевые воздействия накануне родов у крыс влияет на изменение фагоцитарной активности у плода и новорожденных крысят в первые пять суток.

Ключевые слова: боль, роды, фагоцитоз, новорожденные, врожденный иммунитет.

Now labor pain relief in system of obstetric aid held a firm place and there are no signs of the fact that it will give in. At the same time, in recent years much actual material testimonial of violation of early adaptation of the newborn to environmental conditions in case of labor pain relief [1, 18, 19, 3, 4]. In this work the research objective to find out as painful impacts on the eve of labor at rats influence on the activity of phagocytosis at a fetus and newborn rats in the first five days is set.

Keywords: pain, labor, phagocytosis, newborn, congenital immunity.

Боль при родах носит висцеральный и соматический характер [5].

Острую боль 3–4 степени интенсивности моделировали путем электрокожного раздражения рецепторной зоны корня хвоста крыс с одновременным раздражением прямой кишки через параллельно включенные электроды электрическим током, генерируемым электростимулятором ЭСУ-2 со следующими параметрами: частота тока — 100 Гц; амплитуда тока — 30 В; длительность импульса — 500 мс; задержка импульса — 2мс и время стимуляции — 2 минуты. Электростимуляции. Проводили трижды с интервалом с 3 часа на 21 день беременности.

На основании анализа поведенческих и вегетативных реакций опытных животных оценивали интенсивность болевого раздражения в соответствии с общепринятыми критериями Вальдмана А. В. и Васильева Ю. Н. в модификации Овсянникова В. Г. [12].

Все манипуляции с экспериментальными животными проводили в соответствии с Приказом МЗ РФ № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики» от 19 июня 2003 г. [6]

Для изучения фагоцитарной активности нейтрофилов животные декапитировались, осуществлялся забор крови.

Фагоцитарная активность нейтрофилов в периферической крови экспериментальных животных изучалась следующим образом: в пробирку набирают по 0,2 мл гепаринизированной крови, добавляют по 0,1 мл взвеси Staphylococcus aureus «Covan», выращенных на агаре Хоттингера при 37⁰С в течение 24 часов и убитых кипячением на водяной бане в течение 30 мин, аккуратно перемешивают. Ставят в термостат на 1 час при 37⁰С.

Для определения процента активных нейтрофилов (ПАНф) на предметное стекло наносят 40 мкл исследуемого материала и готовят мазок.

После полного высыхания мазки фиксируют 20 минут, затем окрашивают по Романовскому-Гимза 20 мин. После экспозиции краску смывают дистиллированной водой, высушивают мазки.

Пробирки выдерживают в термостате еще 3 часа для определения в дальнейшем переваривающей способности нейтрофилов. После срока инкубации готовят мазки описанным выше способом и окрашивают по Романовскому-Гимза. Окрашенные мазки изучают под иммерсионным микроскопом.

Подсчитывают процент активных фагоцитов — число нейтрофилов с захваченными микробами. Для определения фагоцитарного числа (ФЧ) суммарное число фагоцитарных частиц активными лейкоцитами делят на число активных лейкоцитов из числа ста подсчитанных.

Определяют индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) по формуле:

ИЗФ= (ФЧ₁-ФЧ₂)/ФЧ₁

Чем интенсивнее процент киллинга, тем выше положительное значение ИЗФ.

Фагоцитарная активность нейтрофилов уплода крыс до ипосле родов.

Процент активных нейтрофилов (ПАНф) у приплода интактных крыс родов и после родоразрешения. В данном разделе приведены исследования активности нейтрофилов (в процентах) после одночасовой экспозиции периферической крови крыс с культурой микроорганизмов (ПАНф-1).

У приплода находящегося в чреве интактных крыс накануне родов ПАНф-1 составляет 56,40±2,38 %.

Процент активных нейтрофилов ПАНф-1 у приплода после родоразрешения несколько повысился и составляет 61,20±1,98 %. Статистического подтверждения этот факт не получил (p=0.140). При всем том, что статистический анализ не выявил значимых изменений, нельзя проходить мимо того фактора, что сам акт родов так или иначе несколько повысил % активных нейтрофилов.

Интересующий показатель (ПАНф-1) у плода на третье сутки после родов интактными крысами составил 58,30±2,42 % (p=0.596).

На пятые сутки после рождения интактными крысами у приплода ПАНф-1 составляет 51,30±2,06 % (p=0.150).

Таким образом, процент активных нейтрофилов остается практически неизменным как до родов, так и после них.

Тем не менее, вообще пренебрегать фактом (хотя и не подтвержденным) повышения процента нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, не следует. Требуются дополнительные исследования.

После пролонгирования экспозиции, взятой для исследования крови у приплода с микробной культурой еще на 3 час ПАНф-4 у животных, находящихся в чреве матери, не получившей алгогенного воздействия, составил 46,20±1,98 %.

В первые сутки после родов ПАНф-4 у приплода составил 52,50±1,98 % (p=0,088), что свидетельствует об увеличении процента активных нейтрофилов, но еще не является показателем увеличения переваривающей способности изучаемых фагоцитов.

Через трое суток после родов ПАНф-4 составляет 47,60±2,01 % (p=0.570).

На пятые сутки ПАНф-4 равен 43,30±2,06 % (p=0.273).

Таким образом, после родов процент участвующих в фагоцитозе нейтрофилов увеличивается, но является ли это показателем активации киллинговой активности, покажут следующие исследования.

Фагоцитарное число (ФЧ) уприплода интактных крыс до родов ипосле родоразрешения.

Как и в предыдущей серии экспериментов определения активности проводились в смеси крови приплода с микроорганизмами. Первое измерение проводилось через 1 час после начала инкубации, второе темя часами позже, т. е. через четыре часа после инкубации.

У приплода, находящегося в чреве матери накануне родов ФЧ-1 имеет значение 3,12±0,07.

В первые сутки после родов приплода интактными крысами ФЧ-1 равно 2,92±0,14 (p=0,405).

На третьи сутки после родов ФЧ-1 имеет величину 2,45±0,24 % (p=0,004). Различие высоко значимо, оно свидетельствует, что на 3-е сутки после родов нейтрофилы приплода менее активно захватывают микробные тела, нежели до родов.

На пятые сутки ФЧ-1 составляет 2,60±0,101 % (p=0,001). Отличие так же высокозначимо по сравнению с внутриутробным периодом жизни приплода, но значимо в сторону уменьшения.

Второе измерение, проведенное тремя частями позже, показало, что ФЧ-4 у животных, находящихся в чреве беременной самки накануне родов, составляет 2,73±0,08.

После родов, в течение первых 24 часов ФЧ-4 составляет 2,43±0,11 (p=0,075), иными словами ФЧ-4 после родов статистически значимо снизилось, что можно расценивать, как активацию киллинговой активности нейтрофилов.

На третьи сутки ФЧ-4 у приплода равен 2,11±0,10 (p=0,001).

На пятые сутки картина сохраняется. ФЧ-4 равно 2,12±0,10 (p=0,0006), что позволяет говорить об активации переваривающей способности нейтрофилов.

Результаты данного исследования интересны, если их сравнивать с фагоцитарным индексом крыс, участвующих в родах. Сам акт родов у них практически не изменил киллинговую активность нейтрофилов, тогда как у приплода, после его рождения способность дезинтеграции микробов возрастает.

Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) уприплода интактных крыс до родов ипосле родов.

Находясь в утробе матери ИЗФ составляет 0,13±0,01.

После родов ИЗФ составляет 0,16±0,02 (p=0.104). Весьма условно можно говорить о наметившейся тенденции увеличения ИЗФ.

На третьи сутки ИЗФ равен 0,20±0,02 (p=0.091).

Аналогичные показатели прослеживаются и на пятые сутки после родов. ИЗФ=0,19±0,02 (p=0.028).

Таким образом, сам акт родов коррелирует с увеличением поглотительной и киллинговой активности нейтрофилов у приплода и, очевидно, напрямую связан с ним, как средство превентивной защиты от возможной инфекции.

Процент активных нейтрофилов (ПАНф) уприплода до родов ив раннем послеродовом периоде, матери которых накануне родов подверглись болевому воздействию.

Напомним, что накануне родов у приплода, находящегося в чреве интактной матери, процент активных нейтрофилов ПАНф-1 составляет 56,40±2,38 %.

После нанесения болевого раздражения самке, находящейся накануне родов ПАНф-1 составляет 79,70±1,89 % (p=0,0001).

Это очевидный, статистически высокозначимый прирост.

Судя по графику, сразу после родов и в течение пяти суток после них ПАНф-1 плавно снижается, но не достигает контрольных цифр.

ПАНф-1 сразу после родов стимулированной самкой составляет 77,90±1,82 (p=0,0002).

Третьи сутки ПАНф-1 равен 73,40±1,74 (p=0,0003).

Пятые сутки ознаменовались сохранением показателей ПАНФ-1 примерно на прежнем уровне.

Таким образом, болевая стимуляция беременной самки привела к вовлечению в процесс большего числа нейтрофилов у приплода, однако это еще ее говорит об эффективности фагоцитоза.

Пролонгирование экспозиции крови животных с культурой микроорганизмов на 3 часа показало, что ПАНф-4 у приплода, находящегося в чреве беременной самки, составляем 46,20±1,98.

После электроболевой стимуляции беременной самки накануне родов у приплода ПАНф-4 возрастает до 67,60±2,84 (p=0,0003). Различие с предыдущим показателем статистически высокозначимо.

На протяжении всего опыта ПАНф-4 продолжает оставаться повышенной по отношению к первому измерению (в чреве беременной, не стимулированной самки накануне родов).

Так на первые сутки после родов ПАНф-4 у приплода составляет 68,00±2,18 (p=0,0001).

На третьи сутки после родов ПАНФ-4 у приплода имеет среднее значение 68,520±1,81 (p=0,0001).

На пятые сутки после родов ПАНф-4 у новорожденных крысят, рожденных стимулированными крысами, равен 60,70±2,80 (p=0,004).

Таким образом, электроболевая стимуляция беременных крыс привела к всплеску активности нейтрофилов, точнее увеличению их участия в процессе фагоцитоза. Надо заметить, статистически высокозначимые отклонения в сторону повышения коснулись как ПАНф-1, так и ПАНф-4. Это свидетельствует об активации нейтрофилов, но отнюдь не о повышении их переваривающей способности. В последнем случае ПАНф-4 должно было бы снижаться, т. е. за дополнительные 3 часа, во многих нейтрофилах микробы могли быть разрушены, более ясной картина станет при изучении ФЧ-1, ФЧ-4 и ИЗФ.

Фагоцитарное число (ФЧ) уприплода крыс, подвергнутых алгогенному воздействию накануне родов.

У приплода, находящегося в чреве беременной, не стимулированной крысы ФЧ-1 равно 3,12±0,07.

После алгогенного воздействия на беременную крысу накануне родов ФЧ-1 приплода составил 3,55±0,26 (p=0,325).

После родов ФЧ-1 у новорожденных составил 3,29±0,14 (p=0,140). Статистически значимых изменений не произошло.

На третьи сутки после родов ФЧ-1 составляет 3,06±0,05 (p=0,733).

На пятые сутки существенных изменений поглотительной способности нейтрофилов так же не произошло. Среднее статистическое значение составляет 3,23±0,08 (p=0,325).

Таким образом, электроболевая стимуляция беременных самок накануне родов не привела к изменению поглотительной способности нейтрофилов приплода.

Более длительная экспозиция крови приплода с микроорганизмами ФЧ-4 составило 2,73±0,08. Речь идет о приплоде, матери которого не получали электроболевую стимуляцию.

Последовавшая накануне родов электроболевая стимуляция беременных самок привела к снижении. ФЧ-4 у приплода до 2,66±0,29. Но это снижение не находит статистического подтверждения (p=0,496).

После родов ФЧ-4 увеличивается до 2,90±0,25 (p=0,069) это увеличение статистически значимо. Последний показатель как раз свидетельствует о весьма вариабельном ответе на болевую стимуляцию, а сам факт повышения ФЧ-4 свидетельствует о низкой (или снижении) переваривающей способности нейтрофилов.

На третьи сутки после родов картина меняется. ФЧ-4 равняется 2,38±0,06 (p=0,002). В этой серии эксперимента именного на 3-й день после родов стимулированными крысами ФЧ-4 снижается по сравнению с ФЧ-1. Что может говорить об активации киллинговой активности.

Реакция не продолжительна. Уже на 5 сутки после родов ФЧ-4 статистически не отличается от первоначальных значений. Оно равно 2,74±0,11 (p=0,791).

Таким образом, в динамике эксперимента ФЧ-4 возрастал после болевой стимуляции и, лишь на третьи сутки, имело место статистически значимое снижение этого показателя. Сама реакция носила не стойкий характер.

Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) уприплода крыс, подвергнутых алгогенному воздействию накануне родов.

ИЗФ у приплода интактных самок накануне родов составил 0,13±0,01. После алгогенного раздражения самок накануне родов, ИЗФ их потомства возрастает вдвое и составляет 0,26±0,05 (p=0,021), это увеличение статистически подтверждено.

Казалось бы, логичным было ожидать сохранение ИЗФ после родов. Но, уже в первые сутки у приплода ИЗФ равен 0,10±0,03 (p=0,150).

На третьи сутки после родов у крысят, рожденных стимулированными самками, картина меняется. ИЗФ возрастает до 0,22±0,02 (p=0,004).

Таким образом, на третьи сутки отмечается наибольшая киллинговая активность нейтрофилов, но она не6 продолжительна. И на пятые сутки стихает. ИЗФ равен 0,18±0,03 (p=0,273).

В общей структуре эксперимента прослеживается факт активации нейтрофилов у приплода в ответ на болевое раздражение беременной самки. Сама болевая информация явно транслируется приплоду, повышается значение исследуемых показателей, но оно ее отражает эффективности процесса, его профилактической направленности. Единственное исключение- это увеличение киллинговой активности нейтрофилов на треть и сутки после родов и как следствие повышение ИЗФ. Есть основание полагать, что краткосрочная реакция носит характер физиологической настройки (тренинга), которая может включаться в последующем, в случае попадания в организм инфекции.

Основания для такого предположения есть. Так, было показано, что в ответ на острую боль активируются кислородзависимые и кислороднезависимые механизмы киллинга [7, 11, 20], повышается активность лизоцима в периферической крови животных [8,10], нарастает уровень гамма-интерферона [9], провоспалительных цитокинов [16, 17], С-реактивного белка [13,14,15].

Такая краткосрочная активация факторов врожденного иммунитета в ответ на болевое раздражение было названо «Синдромом мобилизационной готовности» [2].

Описанные выше факты вполне укладываются в это понятие.

Выводы: 1. Болевая стимуляция беременных самок накануне родов приводит к активации нейтрофилов плода.2. Болевая стимуляция беременных самок сопровождается повышением киллинговой активности новорожденных особей на третьи сутки их жизни.

Литература:

1. Абрамченко, В. В. Обезболивание родов / В. В. Абрамченко. — Н. Новгород: НГМА, 1999. — 171 с.
2. Алексеева, Н.С. Механизмы изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли: дис. … кандидата медицинских наук: 14.00.16 / Н. С. Алексеева. — Ростов-на-Дону, 2009–170 с.
3. Бычкова, С. В. Оценка клеточного звена иммунитета в раннем периоде адаптации детей, родившихся при оперативном родоразрешении / С. В. Бычкова, Г. Н. Чистякова, И. И. Ремизова, И. А. Газиева // Медицинская иммунология. — 2011. — Т.13, № 4–5 (Материалы XIV Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В. И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге, СПб, 23–26 мая 2011 г.). — С. 419–420.
4. Бычкова, С. В. Клинико-иммунологическая оценка адаптации новорожденных в зависимости от вида анестезии при кесаревом сечении: автореферат дис.... кандидата медицинских наук: 14.01.08 / С. В. Бычкова. — Екатеринбург, 2012.- 26 с.
5. Зильбер, А. П. Акушерство глазами анестезиолога / А. П. Зильбер, Е. М. Шифман. — П.: ПГУ, 1997. — 397 с.
6. Об утверждении правил лабораторной практики: приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19 июня 2003 г. — М., 2003. — 7 с.
7. Овсянников В. Г. Онтогенетические особенности изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой боли / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, Н. Е. Николаев, Бордюшков Ю. Н., Алексеев В. В., Алексеева Н. С. // Современные проблемы науки и образования, 2012. — № 2 (URL: http://www.science-education.ru/102–5846)
8. Овсянников, В. Г. Активность лизоцима при острой соматической боли у крыс месячного возраста / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, В. В. Алексеев, Н. С. Алексеева, М. В. Абрамова, В. Е. Николаев // Медицинский вестник Юга России, 2014. — № 3. — С.129–132.
9. Овсянников, В. Г. Динамика цитокиновой активности при острой боли различной локализации / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, В. В. Алексеев, М. В. Бликян, В. Е. Николаев, Н. С. Алексеева, Т. А. Бойченко, Н. А. Алексеева, И. М. Котиева, А. В. Лабушкина, М. В. Абрамова // Журнал фундаментальной медицины и биологии. — 2012. — № 1. — С.82–86.
10. Овсянников, В. Г. Изменение уровня лизоцима при острой соматической боли у взрослых крыс / В. Г. Овсянников, С. В. Шлык, А. Е. Бойченко, В. В. Алексеев, М. В. Бликян, Н. С. Алексеева, М. В. Абрамова // Медицинский вестник Юга России, 2013. — № 3. — С.66–68.
11. Овсянников, В. Г. Особенности кислородзависимого механизма микробицидности лейкоцитов в динамике острой висцеральной боли / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, Н. С. Алексеева, В. В. Алексеев // Российский журнал боли, 2011. — № 2. — С. 16.
12. Овсянников, В. Г. Очерки патофизиологии боли / В. Г. Овсянников. — Ростов н/Д.: Цветная печать, 2003. — 159 с.
13. Овсянников, В. Г. С-реактивный белок крыс и их потомства до и после родов / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, М. В. Абрамова, В. В. Алексеев, А. В. Лабушкина, Н. А. Алексеева, Н. С. Алексеева // Современные проблемы науки и образования, 2015. — № 6 (URL: www.science-education.ru/130–23204)
14. Овсянников, В. Г. С-реактивный белок при острой соматической боли у новорожденных и прозревших крыс / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, В. В. Алексеев, Н. С. Алексеева, Н. А. Алексеева, М. В. Бликян, М. В. Абрамова // Цитокины и воспаление, 2015. — Т.14. — № 1. — С.24–26.
15. Овсянников, В. Г. С-реактивный белок при острой соматической боли / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, М. В. Бликян, В. В. Алексеев, Н. С. Алексеева, М. А. Лебедев, И. М. Котиева // Цитокины и воспаление, 2013. — Т.12. — № 1–2. — С.22–25.
16. Овсянников, В. Г. Цитокиновая активность при заболеваниях, сопровождающихся острой болью / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, В. В. Алексеев, В. Е. Николаев, М. В. Бликян, Н. С. Алексеева, Т. А. Бойченко, Н. А. Алексеева, А. В. Лабушкина, М. В. Абрамова // Владикавказский медико-биологический вестник. — 2011. — Т.13., Вып.10. — С.35–41.
17. Овсянников, В. Г. Цитокиновый ансамбль при острой соматической боли / В. Г. Овсянников, А. Е. Бойченко, В. В. Алексеев, М. В. Бликян, Н. А. Алексеева, Т. А. Бойченко, Н. С. Алексеева // Цитокины и воспаление. — 2012. — Т.11., № 3. — С. 136–138.
18. Русел, Р. Анестезиолог и устранение боли в родах / Р. Руссел // Материалы 7-го Всероссийского съезда анестезиологов реаниматологов. — Санкт-Петербург, 2000. — С. 73–78.
19. Царегородцев, И. С. Особенности постнатальной адаптации новорожденных, родившихся у матерей, получивших в родах эпидуральную анестезию: диссертация... кандидата педагогических наук: 14.00.09 / И. С. Царегородцев.- Уфа, 2008.- 176 с.
20. Шестопалов, А. В. Структурно-цитохимические критерии активации нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль / А. В. Шестопалов, В. Г. Овсянников, Н. С. Алексеева // Кубанский научный медицинский вестник, 2009. — № 5. — С.148–152.