Роль полиморфных вариантов гена глутатионпероксидазы-1 в формировании предрасположенности к профессиональному хроническому бронхиту

Хронический обструктивный бронхит – это заболевание, характеризующееся хроническим воспалением бронхов, ведущее к прогрессирующему нарушению вентиляции по обструктивному типу и проявляющееся кашлем, одышкой и выделением мокроты[4] .Хронический бронхит является классическим примером многофакторного заболевания, в реализации которого, наряду с внешнесредовыми факторами, существенную роль играет генетическая компонента[7].Важное значение в защите легких от токсичных продуктов, содержащихся в табачном дыме, атмосфере крупных промышленных городов и воздухе вредных производств, играют ферменты системы биотрансформации ксенобиотиков и антиоксидантной защиты[5]. Нами был проанализирован полиморфный локус Pro197Leu гена глутатионпероксидазы-1.

Ключевые слова: профессиональный хронический бронхит, глутатионпероксидаза-1, генотип.

Введение. Хронические заболевания органов дыхания являются серьёзной проблемой современной медицины, что обусловлено широким распространением указанной патологии, высокими показателями инвалидности и смертности населения[3]. Традиционно основными факторами риска развития хронического бронхита считается воздействие производственной пыли и токсических веществ, а также курение[9]. Хронический обструктивный бронхит формируется примерно у 4-25% лиц, работающих во вредных и неблагоприятных производственных условиях[2]. В связи с этим, особую значимость представляет изучение профессионального хронического бронхита. Несмотря на огромное внимание, которое уделяется хроническому обструктивному бронхиту, меры эффективной его профилактики разработаны недостаточно, что затрудняет прогнозирование индивидуальной предрасположенности, тяжести течения и исхода заболевания. Таким образом, поиск информативных генетических маркеров, контролирующих ключевые звенья патогенеза хронического обструктивного бронхита, несомненно, является одной из актуальных и перспективных задач медицинской генетики[1]. Исследования последних лет показывают, что ключевую роль в патогенезе многих заболеваний легких играет свободнорадикальное окисление[6]. Легкие наиболее уязвимы в отношении оксидативного повреждения, так как непосредственно подвергаются действию кислорода, а также оксидантов, содержащихся в загрязненном воздухе. При этом большое значение имеет образование активных форм кислорода в результате дисбаланса в системе «оксиданты – антиоксиданты»[10], что, по существу, является пусковым механизмом повреждения бронхов и развития хронического обструктивного бронхита[11]. В этой связи, несомненно, что изучение генов, контролирующих активность ферментов антиоксидантной защиты является важной задачей при исследовании предрасположенности к заболеваниям дыхательной системы, вызванных действием производственных факторов и сигаретного дыма.

Материалы и методы. В работе использованы образцы ДНК 122 больных с профессиональным хроническим бронхитом, из которых 85 человек (69,67%) страдали пылевым и 37 (30,33%) – токсико-пылевым бронхитом.

В качестве группы сравнения были обследованы 166 высокостажированных здоровых рабочих Учалинского горно-обогатительного комбината.

Выделение ДНК. Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови. Для выделения ДНК использовался стандартный метод фенольно-хлороформной экстракции с небольшими модификациями (микрометод) [9]. Раствор ДНК хранили при температуре ‑20°С.

Проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и рестрикционного анализа. Анализ полиморфного локуса Pro197Leu гена GPX-1 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере «Терцик» производства компании “ДНК-технология” в автоматическом режиме в стандартных условиях с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus ("Сибэнзим", Россия). Перечень исследованных локусов, последовательности локусспецифических олигонуклеотидных праймеров, а также номенклатура аллелей представлены в табл. 1.1. Полиморфизм локуса ген GPX-1 исследовали методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Таблица 1.1 Тип полиморфизма, последовательности праймеров, ферменты рестрикции и номенклатура аллелей полиморфных ДНК-локусов.

Проведение электрофореза и визуализация результатов. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 7-8%-ном полиакриламидном неденатурированном геле (ПААГ). После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл) в течение 10 минут и анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Размеры аллелей определяли путем сравнения с маркером, шаг которого равнялся 100 пн.

            Статистический анализ. Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов статистических программ: Statistica 6.0, Microsoft Access, BIOSTAT (Primer of Biostatistics version 4.03).

            Результаты и обсуждение. В группе больных профессиональным бронхитом и здоровых рабочих нами был проанализирован полиморфный локус Pro197Leu гена глутатионпероксидазы 1 (GPX-1) (табл.1.2). Сравнение общей выборки больных профессиональным бронхитом и здоровых индивидов показало сходство в распределении частот генотипов и аллелей локуса Pro197Leu гена GPX-1 (χ2=3.39, df=2, р=0.18 и χ 2=0.68, df=1, р=0.41, соответственно). Сравнительный анализ в указанных группах с учетом этнической принадлежности респондентов статистически достоверных различий не выявил.

GPX, наряду с каталазой является важным компонентом антиоксидантной защиты не только лёгких, но и всего организма в целом, поскольку участвует в разрушении перекиси водорода и окисленных липидов. В организме человека представлено 5 форм GPX. Вероятно, GPX-1, которая является классической глутатионпероксидазой, не принимает участия в патогенезе заболеваний органов дыхания, глутатионпероксидаза-3 (GPX-3), напротив, является собственно лёгочной [8]. Таким образом, целесообразным в дальнейшем представляется изучение именно GPX-3.

Таблица 1.2Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса Pro197Leu гена GPX1 у больных профессиональным хроническим бронхитом и здоровых рабочих

ЛИТЕРАТУРА:

            1.Гичев Ю.П. //Загрязнение окружающей среды и здоровье человека (Печальный опыт России) , Новосибирск, СО РАМН. - 2002. – 230 с.

            2.Лещенко И.В., Овчаренко С.И, Шмелёв Е.И.// Хроническая обструктивная болезнь. Руководство для врачей/ Федеральная программа.- М.: 2004.-62 с.

3.Чучалин А.Г.// Хронические обструктивные болезни легких. - М.: БИНОМ. – 1999. - 512 c.

            4.Шмелёв Е.И. Хронический обструктивный бронхит // Хроническая обструктивная болезнь лёгких / Под ред. А.Г. Чучалина . М . -1998.- С. 402.

       5.Baranov V.S., Ivaschenko T., Bakay B. et al. Proportion of the GSTM1 0/0 genotipe in some Slavic populations and its correlation with cystic fibrosis and some multifactorial diseases // Hum.Genet.- 1996.- Vol.97. P.516-520.

            6. Bastaki M., Huen K., Manzanillo P., Chande N., Chen C., Balmes J.R., Tager I.B., Holland N. Genotype-activity relationship for Mn-superoxide dismutase, glutathione peroxidase 1 and catalase in humans//Pharmacogenet Genomics. -2006.- Vol.16(4).- P. 279-86.

7. Christiani D.C. Occupation and COPD // Occup. Environ. Med.- 2005.- Vol.62. P. 215.

            8.Kinnula V.L. Focus on antioxidant enzymes and antioxidant strategies in smoking related airway disease // Thorax.- 2005.- Vol. 60. P. 693-700.

            9.Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. Ed. Walker J.M.. - N.Y., L.: Human Press. - 1984. - Vol. 2. - p. 31.

10.Nadif R., Mintz M., Jedlicka A., Bertrand J.P., Kleeberger S.R., Kauffmann F. Association of CAT polymorphisms with catalase activity and exposure to environmental oxidative stimuli//Free Radic Res.-2005.- Vol. 39(12). P.1345-50.

11.Forsberg L., Lyrenas L., de Faire U., Morgenstern R. A common functional C-T substitution polymorphism in the promoter region of the human catalase gene influences transcription factor binding, reporter gene transcription and is correlated to blood catalase levels// Free Radical Biology and Medicine.- 2001.- Vol.30.- №5.-P. 500-505.