Митохондриальная плазмидоподобная ДНК хлопчатника pGHm2



Генетическая инженерия существует немногим более 20 лет. Она показала свои возможности в области прокариотических организмов. Однако новые технологии, применяемые к высшим растениям пока не столь значительны. Попытки применения приемов генетической инженерии к высшим растениям тесно связаны с фундаментальными исследованиями. Важнейшими задачами, стоящими перед генетической инженерией и биотехнологией сегодня, являются: повышение продуктивности сельскохозяйственных растительных культур, создание новых культивируемых в сельском хозяйстве видов, защита окружающей среды и утилизация отходов, создание новых экологически чистых процессов преобразования энергии и получения минеральных ресурсов. Попытки оптимизации любого биотехнологического процесса, в основном, направлены на улучшение их генетических свойств. В настоящее время разрабатываются и применяются принципиально новые методы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК. Модификация генетического материала осуществляется разными методами: в живом организме (in vivo) и вне его (in vitro), это два направления — клеточная инженерия и генетическая инженерия [1].

Генетическое разнообразие живых организмов находится в прямой зависимости от изменений, происходящих в последовательности четырех основных пар, которые образуют молекулу ДНК, и составляют генетический код. Генетическое разнообразие зависит от ядерного, митохондриального и хлоропластного содержания ДНК в клетке, количество хромосом и структуру ДНК.

Изучение структурной организации и выяснение функционирования внеядерных геномов высших растений является одной из наиболее важных задач современной молекулярной биологии. Это определяется биологической ролью хлоропластов и митохондрий в жизни клетки и организма в целом. Известно, что эти органоиды кроме основных своих функций — обеспечение клетки энергией, отвечают также за устойчивость организма к различным стрессовым факторам.

У некоторых организмов найдена цитоплазматическая ДНК, структурно ассоциированная с митохондриями, но отличающаяся от собственной ДНК этих органелл. В нём может находиться до 30 % всей ДНК клетки или даже больше, чем в самом ядре. Цитоплазматические ДНК, совсем не связанные с митохондриями, обнаружены у многих эукариот: животных, дрозофилы, высших растений. В цитоплазме клеток позвоночных найдены кольцевые, сверхспирализованные, либо линейные ДНК, напоминающие плазмиды бактерий. Предполагают, что они имеют ядерное происхождение, но несут локусы ori — точки инициации репликации и поэтому способны к внехромосомному размножению и наследованию. Роль этих плазмидоподобных структур в организмах эукариот не ясна, однако у кукурузы с ними связывают феномен цитоплазматически наследуемой мужской стерильности.

Современная теория и практика защиты растений от болезней должны основываться на глубоких молекулярно-генетических знаниях. Только на основе этих знаний возможно создание эффективных технологий предупреждения развития болезни у пораженных растений предупреждение развития болезни у зараженного растения будет технологией «хай-тек» 21 века [2].

Открываются новые возможности управления устойчивостью растений посредством практического использования комбинированных плазмид для трансформации их в геном растений. Большие успехи достигнуты в таких направлениях, как физико-химический и структурный анализ состава плазмидных ДНК, выявление и изучение пластидных мутаций, генетический и биохимический анализ природных различий, генетическое и физическое картирование и выявление кодирующих фрагментов. Плазмидоподобные ДНК привлекают внимание исследователей как потенциальные векторы для генетической инженерии растений.

Выделение митохондрий из корешков двухдневных этиолированных проростков выполнили по методу Т. Юсупова и др. [3]. Корешки измельчали в буфере для гомогенации (буфер А: 0,3 М сахароза, 50Мм трис-HCl, рН 7,8, 3мМ ЭДТА,0,1 % БСА, 0,1 ПВП 5000 мкг/мл гепарин) в течении 30 сек в высокоскоростном гомогенизаторе МР (Польша). Отфильтрованный гомогенат (3000 обр./мин 10 мин) для освобождения от клеточных обломок, затем митохондрии осаждаются центрифугированием в режиме 12000 обр./мин 45 мин. Органеллы суспендируют в исходном буфере А, наслаивают на ступенчатый градиент (0,6 М: 0,9 М: 1,6 М) центрифугируют при 22000 обр./мин 60 рН 7,8мин. Слой между 1,6 М и 0,9 М сахарозой отбирают, ресуспензируют в буфере 0,05Мм трис-HCl, рН 8,0, 0,02 М ЭДТА, 2 % саркозил натрия, 300 мкг/мл протеиназы К и выдерживали 1 час при 37⁰ С. Лизат дважды депротеинизировали равным объемом насыщенного смесью: фенол — хлороформ (50+50), и один раз — смесью: хлороформ + изоамиловый спирт (24:1). Водную фазу отбирали и осаждали 2,5 объема охлажденного этанола и 3 М ацетат натрия, рН 5,8 до конечной концентрации 0,3 М. осадок должен растворяться в ТЕ буфере (10 мМ трис НСl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА). Добавив к раствору хлористый цезий и краситель центрифугируют в бакет-роторе С–45 ультрацентрифуги К-32 при режиме 37 000 обр./мин в течении 48 часов при 18⁰ С, полученную таким методом ДНК экстрагировали и отмывали от красителя депротеинизацией с последующим осаждением.

Полученные ДНК обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами в соответствующих условиях. Препараты ДНК, продукты реакции с рестрикционными эндонуклеазами анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле разной концентрации в горизонтальных пластинках.

К началу работ по изучению митохондриального генома хлопчатника редко можно было встретить сообщения о плазмидоподобных ДНК (ппДНК). У высших растений существование таких структур ставилось под сомнение. Однако, при выделении препарата ДНК по выше рекомендованной методике вместе с митохондриальной ДНК (мтДНК) хлопчатника обнаружены были и быстро мигрирующие фракции. При сравнении электрофоретической подвижности этих ДНК с линейными фрагментами известной длины установили размер ппДНК, равный примерно 6,5 и 2,3 т. п. н. для pGHm1 и pGHm2, pGВm1 и pGВm2 (p — plasmide, G — Gossypium, H — hirsutum, B — barbadense, M — mitochondrial). В научной литературе опубликовано, что ппДНК обнаружены у кукурузы, сорго, сахарной свеклы, табака и пшеницы. Детально изучены ппДНК кукурузы (s ^-1 и s ^-2).

Структурные компоненты генома такого характера, в частности ппДНК, очень важны в свете их практического использования в новых технологиях для создания новых сортов растений. В связи с этим была поставлена цель: изучение первичной структуры ппДНК pGHm2.

Как выявлено в процессе исследований pGHm2 имела наименьший размер среди других ппДНК — 2,215 т. п. н., но по числу копий на митохондриальный геном (мт-геном) — около 4. Это количество ближе к максимальному числу копий на мт-геном. Для клонирования ппДНК pGHm2 обработали рестриктазой Sal 1 и получили линейный фрагмент. Изучаемая нами ппДНК была подвержена обработке еще девяти эндонуклеаз и выявлены сайты рестрикции, характерные для них.

В составе ппДНК pGHm2 входят уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз Асс I, Bss GII, EcoR I, Kpn I, Pvu I и XbaI (табл.1).

Таблица 1

Сайты рестрикции ппДНК pGHm2 митохондрий хлопчатника

№пп	Ферменты рестрикции	Сайты рестрикции	Координаты сайтов	Количество сайтов
1.	Асс I	GT MKAC	61	1
2.	Bam H 1	G GATCC	1289, 1880	2
3.	Bss GII	G CGCGC	2143	1
4.	EcoR I	G AATTC	2068	1
5.	Hind III	A AGCLL	1203,1303	3
6.	Kpn I,	GGTAC C	2084	1
7.	Pst I	GTGCA	2016,2041	2
8.	Pvu I	CGAT CG	1833	1
9.	Sac I	GAGCT C	707,2078	2
10.	XbaI		1783	1

В первичном составе ппДНК pGHm2 выявлены многочисленные прямые, обращенные повторы и палиндромы. А, как известно, такие структуры могут играть определенную роль в процессе регуляции репликации. Компьютерным анализом первичной структуры pGHm2 выявлено 31 прямой повтор, протяженностью в более чем в 10 нуклеотидов, и шесть из них представлены двумя и тремя копиями. В составе ппДНК идентифицировано два инвертированных повтора, длиной в 10–12 пар нуклеотид. Имеются в ней и несколько палиндромов. Один из них расположен в пределах 1119–1131 и совпадает с открытой рамкой считывания (ОРС) и способен выполнять роль терминатора транскрипции. В pGHm2 выявлено пять ОРС. В ппДНК возникают шпилечные структуры, расположенные в пределах 1379–1392, 1588–1599 и 1841–1952.

Предположение о функции ппДНК, о перемещении их между геномами органелл уподобляет их мобильным генетическим элементам с присущими им функциями и структурами. Для проверки такой гипотезы были сопоставлены нуклеотидные последовательности pGHm2 со структурными элементами ядерного и пластидного геномов.

Литература:

1. Волова Т. Г. Биотехнология. Учебное пособие. Новосибирск.1999. 254 с.
2. Монастырский О. А., Хомченко Е. В. Цитогенетические механизмы вирулентности рас возбудителей ржавчины пшеницы и фузариоза колоса. (Интернет данные).
3. Юсупов Т., Ибрагимов А. П., Рахматов Н. О., Ирисметов А. А. Получение чистых препаратов мтДНК из проростков хлопчатника и некоторые данные о ее структурной организации // Узб. биол. ж., 1984. № 6. С. 6–8.