Создание линии Drosophila Melsnogaster со сцепленными маркерами YW и изучение ее биологических особенностей



Создана линия Drosophila Melanogaster со совмещёнными маркерами по 1 хромосоме YW, изучены её генетические (частота рекомбинации) и экологические (численность, вторичное соотношение полов).

Ключевые слова: Drosophila Melanogaster, кроссинговер, частота рекомбинации, половая структура популяции

В условиях современной жизни, когда необходимы решение вопросов экологической генетики и разработка новых тест-систем для определения потенциальной опасности новых веществ, количество которых увеличивается год от года, значительно возрос интерес к исследованиям на Drosophila Melanogaster [10–13]. Drosophila Melanogaster — один из наиболее распространённых модельных объектов, обладающих всеми качествами, необходимыми для успешного проведения генетического анализа:

1) незначительный срок развития от яйца до взрослой мухи (10 дней);

2) исключительно высокая плодовитость;

3) богатство наследственных рас или мутаций;

4) малое число хромосом (2n=8);

5) сходные с другими эукариотами пути метаболизма многих химических соединений [9].

Целью нашего исследования было создание линии Drosophila Melanogaster со сцепленными маркерамипо I хромосоме и изучение её генетических (спонтанный кроссинговер) и экологических (численность, половая пропорция) особенностей.

В экспериментах использовалась линия YW — (y — yellow (желтое тело) — I, 0.0; w — white (белые глаза) — I, 1,5 и линия дикого типа Oregon-R) [3]. В лабораторных условиях культуры дрозофилы содержали в термостате при t =24º -25°С на банановой среде. Для определения частоты спонтанного кроссинговера было поставлено 30 пробирочных культур, в которых одна виргильная самка YW/++ скрещивалось с одним самцом YW/Y. Эксперимент проводился в 5 повторностях, т. е. каждый раз родителей содержали вместе 5 дней, затем перебрасывали на новую питательную среду. В ходе исследования в потомстве вёлся учёт мух всех фенотипических классов, как среди самок, так и среди самцов. Потомство появилось только в 18 культурах. Учет дочернего поколения велся до полного вылета имаго. Частоту рекомбинации определяли по результатам анализирующего скрещивания [9]. Оценивали значимость отклонения от теоретически ожидаемого результата методом χ² [6].

Явление кроссинговера было открыто на дрозофиле Т. Х. Морганом и оказалось общим для всех животных, растений, микроорганизмов [5, 8]. Современные модели кроссинговера являются производными от модели Холидея [12]. Модель Холидея включает следующие стадии:

1) разъединение полинуклеотидных цепей двойной спирали ДНК в каждой из двух гомологичных хроматид;

2) образование «гибридных» молекул ДНК, образующихся из полинуклеотидной цепи, принадлежащей одной хроматиде, и другой полинуклеотидной цепи, принадлежащей гомологичной хроматиде;

3) генную конверсию, возникающую в результате замены ошибочно вставленных оснований в «гибридных» молекулах ДНК. Из природы кроссинговера следует, что он должен включать разрывы молекул ДНК и затем синтез ДНК, необходимый для того, чтобы соединить разорванные молекулы, которые участвуют в кроссинговере.

Таким образом, существует следующий порядок событий для мейотического кроссинговера: вначале происходит образование разрывов в специфических участках молекул ДНК с помощью соответствующей эндонуклеазы. Затем возникают одноцепочные участки ДНК. Существует белок, который облегчает реассоциацию одноцепочных участков, и в конце концов все участки молекул ДНК, вовлечённые в кроссинговер, соединяются с помощью репарирующих механизмов [13].

Для того чтобы происходил кроссинговер и формировались хиазмы, необходимо присутствие синаптонемального комплекса [5]. Если синаптонемальный комплекс отсутствует в силу внешних или внутренних причин (т. е. в результате мутаций или экспериментального вмешательства), кроссинговер не происходит и хиазмы не формируются [12].

Частота мейотического кроссинговера (rf — frequencies recombination) зависит от многих факторов окружающей среды. Различные типы излучений: ультрафиолетовый свет, рентгеновские и γ-лучи, корпускулярное излучение, как правило, повышают частоту рекомбинации, вызывая одно- и двунитевые разрывы в ДНК хромосом [13]. Кроме того, частота рекомбинации может увеличиваться в популяциях, которые периодически подвергаются стрессовым воздействиям, а также связано с возрастом и полом особи [4].

Согласно одному из постулатов биологической эволюционной аксиомы, «эволюция органического мира была бы невозможной без генетических рекомбинаций или событий, служивших их аналогами» [5]. Линейное расположение генов в хромосоме обеспечивает свободную комбинаторику генов. Если в одной хромосоме возникла полезная мутация, а в гомологичной хромосоме, пришедшей от другого родителя, также есть полезная мутация, но в другом локусе, то совместиться они могут только путем кроссинговера. Тогда такая рекомбинантная хромосома принесет популяции объединение двух полезных признаков [12].

Зависимость уровня рекомбинаций от среды можно рассматривать как оптимальную стратегию рекомбинационной системы, которая состоит в том, что достигается минимум рассеивания потенциальной генетической изменчивости, когда потребности в ней минимальны, т. е. в благоприятных условиях [13].

Линия YW была получена в результате следующих скрещиваний:

P: ♀♂

F₁: ♀ ♂

F₂: ;;;;

;;;

Из потомства F₂ отбирали желтотелых белоглазых самцов () и скрещивали с желтотелыми красноглазыми самками ( и ). Самки в скрещивании с самцами давали поколение линии YW.

P: ♀ ♂

F₃: ; ; ;

Из поколения F₃ (2-го скрещивания) отбирали желтотелых белоглазых самцов и самок (и) и ставили их на массовое размножение.

Изучение частоты спонтанного кроссинговера между генами желтое тело (y) и белые газа (w), находящимися I хромосоме, в мы проводили по следующему скрещиванию:

P: ♀ ♂

F₁: ♀ ♂

F₂: ;;;;;;;

В ходе нашего исследования в потомстве велся учет мух всех фенотипических классов, как среди самок, так и среди самцов. Спонтанный кроссинговер определялся отдельно по мужским и женским особям, а также по всему потомству (таблица 1).

Таблица 1

Уровень спонтанного кроссинговера улинии YW/++

№культуры	5			11			15			17			18
	♀	♂	∑	♀	♂	∑	♀	♂	∑	♀	♂	∑	♀	♂	∑
rf (y-w)(%)	-	2,7	1,04	-	2,86	1,56	-	10	3,5	-	5,56	2,78	1,67	-	0,93
χ2 (rfst=1,5 %)	-	0,96 —	0,14 —	-	1,23 —	0,24	-	48,17 +++	2,67 —	-	10.99 +++	1,09 —	1,93 —	-	21,66 +++

Условные обозначения: «+++» — достоверные отличия при P<0,001 (χ²_st=10,89) и k=1; «++» — при P<0,01 (χ²_st =6,64) k=1; «+» — при P<0,05 (χ²_st =3,84) k=1

Из 18 пробирных культур только в 5 был зафиксирован кроссинговер, что составило 28 %. Это возможно вследствие следующих причин: во-первых, из-за небольшой численности потомства, так как мутантная линия YW с двумя рецессивными мутациями обладает пониженной жизнеспособностью и, во-вторых, маленькое расстояние между генами y и w — 1,5 % приводит к появлению небольшого числа рекомбинантного потомства.

Рассматривая кроссинговер у особей разного пола, отметим, что чаще он наблюдался в F_а среди самцов (4 случая), нежели у самок (1 случай). Скорее всего отрицательную роль в этом феномене у гетерозиготных самок +w/ YW и w+/ YW вновь играет хромосома — анализатор YW, которая увеличивает смертность у её носителей. Самцы — гемизиготный пол (XY) не имеют X хромосомы с генами YW, Y-хромосома «вредного влияния» на кроссоверных мух не оказывает. Этими же причинами можно объяснить статистически более значимую величину кроссинговера у самцов (rf_ср=4,59 %, +), чем у самок (rf_ср=1,67 %) — рекомбинантные особи женского пола чаще не выживают.

Если сравнивать частоту спонтанного кроссинговера у разных полов и величину общего кроссинговера со стандартным значением, определенным по генетической карте — 1,5 %, мы выявляем следующее: у самцов она несколько выше, у самок находится в пределах нормы; среднее значение кроссинговера по всем культурам составляет 1,69, что статистически не отличается от табличного значения.

Рассматривая флуктуации показателей rf по повторностям (таблица 2) следует объяснить разной чувствительностью стадий оогенеза к внешним воздействиям [7].

Таблица 2

Значение χ² в каждой повторности на стандартной среде

№повторности	№1	№2	№3	№4	№5
rf	3,19	1,83	0,33	2,057	0,00
χ2 (для rf=1,5 %)	25,96(+++)	10,75(+)	5,77(-)	2,783(-)	14,584(++)

Условные обозначения: «+++» — достоверные отличия при P<0,001 (χ_ф=16,27) и к=3; «++» — достоверные отличия при P<0,01 (χ_ф=11,34) и к=3; «+» — достоверные отличия при P<0,5 (χ_ф=7,82) и к=3; «-» — достоверных отличий нет

Данные анализа, представленные в таблице 2, показывают, что в первой повторности отличия в высшей степени достоверны (χ_ф=25,96 > χ_ф=16,27), о чём свидетельствует высокое значение уровня рекомбинации rf (YW)=3,19 % (табл. 2). Именно эта стадия на основе структурно — морфологических особенностей ядра в онтогенезе дрозофилы относится к ооцитам I класса клеток [7]. Данный класс включает клетки на синаптической стадии мейоза. Ядро таких клеток содержит синаптонемный комплекс — основной атрибут кроссинговера. Поэтому закономерно, что ооциты на этой стадии является рекомбиногенно чувствительным к любому внешнему и внутреннему воздействию. Следовательно, наиболее чувствительным этапом развития ооцитов является ранняя стадия их созревания.

В ходе эксперимента было поставлено 30 индивидуальных культур YW/++ × YW/Y. Потомство дали 18 родительских пар, 12 культуры не развились вследствие стерильности одного или двух родителей (40 %). На жизнеспособных мух могли повлиять мутации y и w, которые значительно снижают численность гомозиготных по этим генам самок, по сравнению с гетерозиготными особями. Из 18 культур в 13 случаях статистически достоверно преобладали мухи дикого типа, в 3 вариантах особи генотипа yw вовсе отсутствовали.

В нашем эксперименте вторичная половая пропорция (♂/♀) в 11 культурах была меньше 1, в 5 культурах — больше 1 и в 2 культурах равна 1. Общая численность самок — 668, самцов — 515, разница статистически достоверна (χ²=19,8 +++ при P>0,001,k=1). Такая диспропорция в сторону женского пола может свидетельствовать об относительно стабильных условиях существования популяции. Кроме того, согласно концепции В. А. Геодакяна, у самцов одна X-хромосома, а у самок 2 X-хромосомы, одна из которых может компенсировать поврежденный локус в гомологичной половой хромосоме, поэтому самки живут дольше и у них норма реакции шире, чем у самцов [2].

Проведённое исследование показало возможность использования линии Drosophila melanogasterYW в решении частных вопросов генетики и экологии.

Литература:

1. Бочков Н. П. Клиническая генетика: учебник; под ред. Н. П. Бочкова. — 4-е изд. доп. и перераб. — М.: ГЭОТАР — Медиа, 2015. — 445 с.
2. Геодакян В. А. О структуре самовоспроводящих систем // Сб. науч. трудов. — М: Наука, 1972. — С. 371–379.
3. Захаров И. А. Генетические карты высших организмов. — Ленинград. изд-во: «Наука», 1979. — 215 с.
4. Имашёва А. Г. Стрессовые условия среды и генетическая изменчивость в популяции животных // Генетика. 1999. Т. 35. № 4. С. 421–431.
5. Инге-Вечтомов С. Г. Генетика с основами селекции: учебник для студентов высших учебных заведений. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2010. — 720 с.
6. Лакин Г. Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1990. – 352 с.
7. Левин В. Л., Шварцман П. Я. Гены детерминирующие развитие у дрозофилы. — М.: ВИНИТИ, 1991. — 132 с.
8. Никольский В. И. Генетика. — М.: «Академия», 2010. — 56 с.
9. Орлова Н. Н. Генетический анализ / Н. Н. Орлова. — М.: Из-во МГУ, 1991. — 371 с.
10. Сидорская В. А. Изучение токсических эффектов мутагенов прямого и косвенного действия на линиях Drosophila melanogaster со совмещёнными маркерами // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. 2014. № 3 (62). Ч. 1. С.36–38.
11. Сидорская В. А. Изучение экологических и генетических эффектов ацетилсалициловой кислоты и аскорбиновой кислоты Drosophila melanogaster // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. 2013. № 10 (57). Ч. 1. С. 36–38.
12. Чадов Б. Ф. Модель регуляции кроссинговера // Генетика. 1999. Т. 35. № 4. С. 459–466.
13. Чубыкин В. Л. Модификация частоты кроссинговера и механизм хромосомного контроля распределения обменов у самок дрозофилы // Генетика. 1997. Т. 33. № 9. С. 1189–1197.