Искусственное оплодотворение спермой донора — вспомогательная репродуктивная технология



В обзоре представлены основные вопросы и методы введения искусственного оплодотворения, данные исследований нормальной спермограммы сперматозоидов, культивирование на средах, улучшения состояние сперматозоидов. Также представлены статистические данные успешного ЭКО и отрицательного.

Ключевые слова: искусственное оплодотворение, сперма донора, тестостерон

Инфертильность, т. е. неспособность иметь потомство, тяжелое состояние, нарушающее социальную и психологическую адаптацию человека, влияющая на его здоровье и качество жизни [2,10,11,14] Частота бесплодных браков в мире достигает 15 %,а в нашей стране по данным отечественных исследователей составляет 12–15 % и имеет тенденцию к росту [1,12,15,13]Разработка и внедрение в клиническую практику оплодотворение в «пробирке» in vitro дали возможность получать беременность при бесплодии, обусловленном различными причинами, у 30 % инфертильных пациенток. [2]

Современные программы с применением оплодотворения in vitro помимо «классического» ЭКО, включает в себя инъекцию сперматозоида в цитоплазму яйцеклетку, преимплантационную диагностику наследственных заболеваний, использование донорских гамет и эмбрионов, суррогатное материнство, замораживание подовых клеток и эмбрионов. [2] После рождения в 1978 году первого «ребенка ЭКО» Луизы Браун, с помощью методов ВРТ на свет появилось уже свыше 5 миллионов детей (ICMART 2012). К сожалению, не каждый цикл ЭКО приводит к рождению живого ребенка. Около 15–20 % беременностей после ЭКО прерываются по тем или иным причинам [5]. Эффективноть применения ВРТ нередко снижается из-за того, что к ним прибегают слишком поздно по причине необоснованно длительного использования других методов восстановления естественной фертильности, оказывающихся в конечном счете неэффективными [2]. Несмотря на некоторые минусы, все же эти технологии востребованы в лечения бесплодия.

Сравнительный анализ клинической эффективности ВРТ показал, что результаты работы российских центров не отличаются от европейских. Так, частота наступления беременности после переноса эмбрионов в России составляет 28,4 %,в европейских странах-17,9–44 %. В программе переноса размноженных эмбрионов этот показатель составляет 20,5 % в России и 14,7 % — в европейских странах. [5]

Последние научные исследования выявили положительное влияние витамина D на результативность ЭКО. Оказывается, у женщин с нормальным уровнем витамина D в крови шансы забеременеть почти в 2 раза выше по сравнению с теми, у кого наблюдается его дефицит. Витамин D способствует созреванию качественных яйцеклеток, успешной имплантации эмбрионов, улучшает ответ яичников на стимуляцию, снижает риск развития синдрома поликистозных яичников. [9]

Также было проведено исследование морфологических характеристик сперматозоидов человека. [3] Были использованы следующие методы и материалы. При оценке эякулята часто выявляется изменение не только спектра морфологических типов сперматозоидов, но и таких показателей спермограммы, как концентрация, доля прогрессивно подвижных и морфологически нормальных клеток, а также степень их подвижности. Снижение значений основных показателей спермограммы приводит в ряде случаев к уменьшению частоты оплодотворения ооцитов в культуре. Для повышения эффективности оплодотворения ооцитов человека в культуре рекомендуется увеличить концентрацию сперматозоидов в среде инсеминации или же использовать метод инъекции сперматозоидов в цитоплазму ооцитов (метод ICSI). Прогностическая значимость отдельных показателей спермограммы и морфологических признаков мужских подовых клеток для оценки вероятности оплодотворения ооцитов в культуре также по-разному оценивается различными исследователями. [3,4]

На основе анализа результатов оплодотворения ооцитов in vitro у 304 пациенток, проходивших лечение бесплодия в Международном центре репродуктивной медицины НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН. Выделение фракции прогрессивно подвижных сперматозоидов осуществляли центрифугированием эякулята в Перколле с последующим проведением процедуры всплытия. Инсеминацию ооцитов проводили в микрокаплях под минеральным маслом. Используемая для инсеминации ооцитов концентрация прогрессивно подвижных сперматозоидов в среде составляла 100 000 в 1 мл. Контроль оплодотворения проводили по наличию двух пронуклеусов через 18 часов после инсеминации. [3]

Для оценки морфологии сперматозоидов использовали модифицированную классификацию Крюгера и соавторов [4]. Определение доли клеток с различении морфологическими характеристиками проводили при увеличении 1000х (об.100х, ок. 10х), просчитывая по 200 клеток на каждом препарате. Для морфологически нормального сперматозоида характерны овальная форма головки длиной 5–6 мкм и длиной 2,5–3,5 мкм, акросомальный участок, занимающий от 40 до 70 % площади головки, отсутствие аномалии в области шейки, хвоста и среднего отдела. [3]К пограничным формам относили клетки с хорошо выраженным акросомальным участком, имеющие слегка удлиненную головку диаметром 2,0–2,5 мкм или небольшие утолщения в области шейки. [3] Выделяли следующие основные типы морфологических аномалии сперматозоидов: патология хвоста (сломанный, закрученный, короткий, удвоенный); отсутствие или уменьшение размера акросомального участка; изменения формы постакросомального участка(конический, грибовидный, лентовидный);аномалии шейки и среднего отдела (сломанная или утолщенная шейка, утолщение или истончение срединного отдела); сперматозоиды с цитоплазматической каплей; микро- и макроцефалы. [4]

Оплодотворение в культуре менее 33 % инсеменрированых ооцитов рассматривали как низкую частоту оплодотворения, а оплодотворения более 66 % — как высокую. [3]

Для оценки стабильности индивидуального спектра морфологических типов сперматозоидов у 59 пациентов анализ этого параметра был проведён двукратно (с интервалом от 14 до 476 суток). Для изучения воспроизводимости результатов анализа морфологии сперматозоидов 50 ранее проанализированных препаратов были перешифрованы и исследованы повторно. Ошибку измерения для каждого из морфологических типов сперматозоидов определяли как среднюю разницу результатов двух наблюдений. [3,4,10]

При повторном анализе морфологии по 50 препаратам выявлена высокая степень корреляции между результатами первого и второго наблюдения для всех морфологических типов сперматозоидов, за исключением доли клеток с так называемыми другими типами аномалий. [4] Полученные данные позволяют сделать вывод о хорошей воспроизводимости и вследствие этого высокой надежности результатов оценки морфологии сперматозоидов. При оценки стабильности индивидуального спектра морфологических типов сперматозоидов с использованием методов факторного дисперсионного анализа не было выявлено существенных различий между результатом повторных наблюдений по таким показателям, как доля морфологически нормальных и пограничных сперматозоидов, доля клеток с аномалиями акросомального участка, изменение форм ядра, патологией хвоста, а также наличием цитоплазматической капли.

В исследуемой группе пациентов (n=304) средняя частота оплодотворения ооцитов составила 71,00+-1,6 %. При этом в 7 случаев (2,3 %) этот показатель не превышает 33 %, в 21 случае (6,9 %) оплодотворение отсутствовало. [3,4]

Также было проанализировано зависимость частоты оплодотворения ооцитов в культуре от концентрации прогрессивно подвижных клеток в эякуляте у пациентов с долями морфологически нормальных сперматозоидов более 14 % (норма).Статистически достоверные различия по частоте оплодотворения ооцитов между этими двумя группами выявлены до значения концентрации прогрессивно подвижных клеток 25 мл в 1 мл. [6]

Аналогичные закономерности были выявлены также при анализе тех циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), в которой было получено 6 ооцитов и более (n=169). При использовании такого подхода зависимость частоты оплодотворения ооцитов от морфологических показателей сперматозоидов в эякуляте выделяется более отчетливо. Об этом свидетельствует как повышение коэффициентов корреляции, так и снижение вероятности ошибки при их определении. Использование такого подхода позволяет дополнительно обнаружить наличие обратно пропорциональной зависимости между оплодотворяющей способностью сперматозоидов и долей клеток с цитоплазматической каплей. [7]

Исследователями также было проанализировано суммарная частота оплодотворения ооцитов в группах пациентов, выделенных на основании определённых морфологических показателей сперматозоидов. Для этого диапазон варьирования данного показателя разбивали на интервалы, для каждого из которых оценивали суммарные частоты оплодотворения ооцитов в культуре. При использовании данного подхода зависимость частоты оплодотворения ооцитов от морфологических типов сперматозоидов была более выражена (R= от 0,64 до 0,88) по сравнению с результатами анализа несгруппированных данных (R=0,12–0,22). В тоже время по сере дальнейшего повышения данных показателей рост частоты оплодотворения происходил более плавно. В среднем вероятность оплодотворения ооцитов достигало 66 % при наличии в эякуляте 11 % морфологически нормальных форм. [7]

В дальнейшем было проведено сравнение результатов оплодотворение ооцитов в культуре у двух групп пациентов: с низкой (менее 33 %; n1=28) и высокой (более или равной 67 %; n2=178) частотой оплодотворения ооцитов в культуре с использованием линейного дискриминантного анализа. Это позволило выявить совокупность факторов, оказывающих существенное влияние на результаты оплодотворения in vitro p<0,004. Наиболее значимыми среди них являются следующие: доля % морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте (F=15,48; P=0,0003); доля % прогрессивно подвижных клеток (F=7,14; P=0,008); степень подвижности сперматозоидов (F=7,0; P=0,008); доля % пограничных форм (F=3,9; P=0,046). [7,10,4]

Таким образом, была исследована зависимость частоты ооцитов человека в культуре от морфологических показателей сперматозоидов,а также проанализирована их прогностическая значимость в диагностике случаев с низкой частотой оплодотворения. По результатам исследования было выявлено достоверное повышение частоты оплодотворения по мере увеличения в эякуляте доли морфологических нормальных форм сперматозоидов, оценённой по модифицированной методике Крюгера [10]. С точки зрения ВОЗ, прогностические рекомендации по оценке мужской фертильности могут несколько различаться в различных лабораториях [8]. Целесообразно при исследовании особенностей оплодотворения ооцитов в культуре использовать для анализа результаты тех процедур ЭКО, в которых число инсеминнированых ооцитов было достаточно большим. Вычисление значений дискриминантной функции позволяет сделать заключение о перспективах предстоящей процедуры оплодотворения ооцитов в культуре и выделить среди пациентов как подгруппу больных, имеющих низкие шансы на успешный исход лечения бесплодия данным методом, так и подгруппу больных, у которых можно достаточно надежно прогнозировать высокую эффективность оплодотворения ооцитов в культуре. [10,4] При неблагоприятном прогнозе необходимо повысить концентрацию сперматозоидов в среде инсеминации или же использовать метод внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида.

Процедура искусственной инсеминации рекомендовано в следующих случаях. Основное показание к ВМИ — шеечный фактор, когда сперматозоиды мужчины обездвиживаются, попав в канал шейки матки. [5] Кроме того, показанием к искусственной инсеминации являются некоторые формы снижения показателей спермы. Как свидетельствует статистика, в наступлении беременности успеха добьется та женщина, которая моложе 30 лет, с обеими проходимыми трубами, принимает препараты для стимуляции овуляции, использует качественную сперму. Эффективность процедуры искусственной инсеминации спермой донора или мужа может быть от 2 % до 40 %. А в среднем составляет не более 15 %. [8]

Для ускорения процесса проникновения сперматозоидов в яйцеклетку ряд исследователей предлагают освобождать ооциты от фолликулярных клеток до инсеминации путём добавления в среду с ооцитами раствора гиалуронидазы (100–300 ед/мл) или механического денудирования. Удаление фолликулярных клеток увеличивает шансы успешного оплодотворения in vitro. [9]

Важнейшим условием фертильности сперматозоидов является способность их пенетрации зрелых яйцеклеток. [5] В естественных условиях сперматозоиды после их прохождения по генитальному тракту приобретают способность проникновения в яйцеклетку. В искусственных средах для получения аналогичных изменений сперматозоиды перед введением их в культурную среду с ооцитами подвергаются обработке. Приготовление спермы для экстракорпорального оплодотворения ооцитов производится по схеме с использованием метода флотации. Эякулят, разжиженный в течение 30–60 мин при температуре 18–20 градусов, разбавляется в культурной среде в соотношении 1:3, 1,5, 1,6 и центрифугируется в течение 10 мин при 1500–2000 об/мин. [6,9] Супернатант отсасывается, осадок ресуспендируется в новой порции среды, центрифугируется, супернатант вновь отсасывается и на осадок осторожно по стенке пробирки наслаивается 1 мл среды, желательно с сывороткой. После этого пробирка с содержимым ставится в термостат при температуре 37 градусов с 5 % СО2 на инкубацию от 15 мин до 1 в зависимости от качества спермы; активно подвижные сперматозоиды всплывают. [7] После инкубации верхний слой отсасывается и исследуется микроскопически. Вся бактериальная флора, лимфоциты спермы остаются в 40–60 % слое после 20-минутного центрифугирование при 2000 об/мин. [6] Активно подвижные сперматозоиды собираются из 90–100 % слоя градиента и подвергаются микроскопическому анализу. [5] В случае высокой бактериальной контаминации спермы (больше 1000 бактерии в 1 мл) или выраженной субфертильности у донора центрифугирование в градиенте плотности позволяет получать с высокой эффективностью свободную от бактерий, лимфоцитов и обогащенную подвижными формами фракцию сперматозоидов [10]. В случае вязкой спермы успешно используется 0,25 % раствор трипсина в фосфатно-солевом буфере, который в объёме 1 мл помещается в пробирку для маструбации, — это позволяет получить быстрое гомогенное разжижение спермы. Маточный раствор трипсина (2,5 %) хранится при 20 градусах. [6,7,8,10] Успех оплодотворения in vitro зависит от таких параметров спермы, как подвижность и концентрация.

Однако точки зрения авторов относительно этих параметров неоднозначны. Одни считают, что подвижность спермы- одна из наиболее важных параметров, определяющих частоту успеха оплодотворения in vitro. Процент оплодотворения in vitro понижается, когда начальная и конечная подвижность спермы была меньше 20 %. [3,5] Другие же, подучили оплодотворение in vitro спермой с низким количеством активно подвижных сперматозоидов у 50 % мужчин. Исследователи, сравнивая 3 концентрации: 250 000, 375 000, 500 000 в 1 мл, пришли к выводу, что инсеминация спермой высокой концентрации приводит к увеличению частоты оплодотворения in vitro. [4,8] Многочисленные работы указывают на успех оплодотворения in vitro при инсеминации спермой с концентрацией 50 000–100 000 в 1 мл активно подвижных сперматозоидов. [9]

Также, очень важное значение для успешного оплодотворения in vitro имеет среда для обработки спермы. Понижение pH среды и уменьшение концентрации ионов Na или повышение концентрации ионов K приводят к понижению pH внутри сперматозоида и одновременно к ингибированию и подвижностям спермы. [6]

Кроме того, важную роль играет организм женщины, в которой будет расти и развиваться будущий плод. Так с 3–5 дней цикла начинается стимуляция яичников гормональными препаратами. С 6–10 дня начинается регулярное наблюдение за ростом эндометрия и фолликулов с помощью УЗИ и показателя уровня эстрадиола в крови [7]. Как только фолликулы созрели и эстрадиол достигает нужного уровня, приём стимулирующих препаратов прекращается и уколом Хорионического Гонадотропина вызывается овуляция. [8] Овуляция происходит через 37–40 часов после укола. Ответ яичников на стимуляцию может быть или очень сильным или очень слабым. Инсеминация проводится на 2-ой день после укола ХЧГ. В этот же день сдаётся сперма. Подготовка спермы такова: необходимо сексуальное воздержание от 2 до 6 дней (но не более 6-им дней; перед сдачей спермы нужно, чтобы мужчина помочился для прочистки уретры;половой орган и руки должны быть чистыми; путём маструбации сперма собирается в специальный флакон и через 20–30 минут после разжижения начинается ее подготовка. Вероятность беременности после инсеминации 10–15 %. Есть риск забеременеть двойней- 15 % случаев и тройней -3 %. [7,8,9] В случае неудачи возможны новые попытки. Но необходимо выдержать перерыв -после менструации, которые начались после неуспешной попытки, нужно дождаться менструации следующего цикла. В среднем, можно провести 6 попыток. Если после 6-ой попытки беременность не наступило, то возможно перейти к следующему методу оплодотворения.

Для улучшения состояние сперматозоидов необходимо следующее. Цинк для мужчин является самым необходимым минералом, на базе которого производится тестостерон. Без цинка не сможет сформироваться молекула тестостерона. Много цинка содержится в морепродуктах, устрицах, орехах, горохе, фасоли. Суточная норма для мужчин 15 мг. [7]

Селен участвует в биосинтезе тестостерона, разрушает вредные для организма вещества, поддерживает работу мужских половых органов и улучшает качество спермы. Селен содержится в морепродуктах, помидорах, чесноке, черном хлебе.Суточная норма для мужчин: 55–70 мкг.

Витамины группы В чрезвычайно полезны для мужчин (особенно B6 и В12). Они отвечают за энергетический обмен и функционирование нервной системы, повышает синтез тестостерона, защищает печень. Много витаминов группы В содержится в молоке, твороге, сыре, рыбе, яйцах, моркови, орехах. Суточная норма для мужчин: B6 составляет 2 мг, B12 2 мкг. Витамин Е-защищает молекулы тестостерона от разрушения. Много витамина Е содержится в орехах, моркови, яйцах, овсянке. Суточная норма для мужчин: 30 мг. [8]

Первостепенную роль в образовании и качестве спермы играет витамин С. Общепринятая среднесуточная доза примерно 100 мг, но можно и увеличить дозу в несколько раз, так как витамин С является водорастворимым витамином и его излишки выводятся организмом с мочой, не причиняя вреда. Много витамина С содержится в цитрусовых плодах, капусте, шиповнике, лимоне, черной смородине, красном перце, хрене. [9,8]

Сведения о роли митохондрий в синтезе тестостерона показали, что тестостерон и 5α-дигидротестостерон (ДГТ) являются основными мужскими половыми гормонами (андрогены). Тестостерон представляет собой андроген, в специфических тканях трансформирующийся ферментом 5α-редуктазой в ДГТ. Именно ДТГ вызывает различные ответные реакции этих тканей. Функцию основного производителя тестостерона в семенниках осуществляют клетки Лейдига. Причём все необходимые для его синтеза белки и ферменты, присутствуют в митохондриях этих клеток. [1,2,3,4,10]

Для успешного стероидогенеза митохондрия должна активно дышать. В связи с этим, любые изменения в состоянии данной функции митохондрии могут оказать влияние на процесс регуляции биосинтеза стероидов. Во время электронно-транспортных реакций в ЭТЦ могут постоянно образуются и накапливаются АФК. Чрезмерный синтез АФК может вызвать кумулятивный окислительный стресс, который, как полагают, является одной из главных причин клеточного старения и снижения способности производить тестостерон в клетках Лейдига. [4]

Таким образом, приведённые выше методы и исследования с учетом всех предложенных рекомендации, позволяют снизить к минимуму возможные осложнения. Так или иначе, методы искусственного оплодотворения дают реальную надежду многим женщинам в ситуациях, которые раньше считались практически безнадежными.

Литература:

1. Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии / Кулаков В. И., Леонов Б. В., Кузмичёв Л. И.. — М.: Медицинское информационное агентство, 2008. -С. 592 с.
2. Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия / Кулаков В. И., Леонов Б. В.. — М.: Медицинское информационное агентство, -2002.-С.726
3. Воробьева О. А., Корсак В. С., Леонтьева О. А. Влияние морфологии сперматозоидов на частоту оплодотворения и нарушения развития эмбрионов в программе ЭКО.-2004.- С. 12.
4. Воробьёва О. А., Скрипкина О. А., Корсак В. С., методы оценки морфологии сперматозоидов и их прогностическое значение в программе ЭКО. Проблемы репродукции.-2008.- С.-71–76.
5. Ашина М. Б. ВРТ:прошлое настоящее,будущее. // Проблемы репродукции.-2010.-№ 3.-С.-54–58.
6. Грищенко В. И., Петрушко М. П. Результативность программы ЭКО в зависимости от количества и качества перенесённых эмбрионов. //Там же.-2004.-№ 1.-С.-44–47.
7. Здановский В. М. Современные подходы к лечению бесплодного брака. Автореф. дисс. д-ра мед.наук.-2000.-С.-12.
8. Кулаков В. И. Репродуктивное здоровье:проблемы, достижения и перспективы.// Там же.- 2004.-№ 2.-С.-6–9.
9. Лукин В. А., Леонов Б. В., Калинина Е. А. // Акушерство и гинекология.-2003.-№ 4.-С.-38–41.
10. Петров Ю. А. Специфика репродуктивного и контрацептивного поведения студентов медицинского университета //Валеология. -2016. -№ 2. –С.31–34.
11. Петров Ю. А. Результаты иммуно-микробиологической составляющей в генезе хронического эндометрита //Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. -2011. -№ 3. –С.50–53.
12. Петров Ю. А. Семья и здоровье. — М.: Медицинская книга,2014.- 312с.
13. Петров Ю. А., Сависько А. А.,, Петрова С. И. Здоровая семья- здоровые дети.-М.:Медицинская книга, 2010. –328с.
14. Рымашевский Н. В., Петров Ю. А., Ковалева Э. А. Слагаемые супружеского счастья. –Ростов-на-Дону: «Феникс», 1995. -415с.
15. Чернышов В. Н., Орлов В. И., Петров Ю. А. Любовь. Семья.Здоровье. — М.:МЕДпресс-информ, 2005. -280с.