Изучение антагонистических свойств новых штаммов лактобацилл



В работе представлены результаты определения антагонистической активности, выделенных из слепых отростков желудочно-кишечного тракта перепелов культур лактобацилл in vitro диффузионными методами.

Ключевые слова: Lactobacillus, тест-штамм, антагонизм, метод лунок, метод перпендикулярных штрихов, метод капель, культивирование, ингибирование

В последние годы серьезной проблемой гуманитарной и ветеринарной медицины стало распространение антибиотикорезистентных штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий [2; 7; 10]. Следует отметить, что повсеместное использование антибиотиков в составе кормов в настоящее время привело также к снижению естественной резистентности организма сельскохозяйственных животных и птицы. Длительная антибиотикотерапия провоцирует угнетение собственной микрофлоры, при одновременном нарушении обменных процессов в организме. В свете сложившейся ситуации актуально применение с целью профилактики и терапии болезней животных и птицы пробиотических микроорганизмов (лактобациллы, энтерококки, бифидобактерии) [1; 3; 11; 12; 13].

Важнейшее практическое значение в микробиологии имеет правильное представление о динамике изменений в составе микрофлоры организма, особенно кишечника, и о возможных путях нормализации микробного ценоза при резких нарушениях количественного и качественного состава микрофлоры, ведущих к состоянию дисбактериоза [2; 4; 6; 8].

Одним из путей искусственного вмешательства в формирование нормального микробиоценоза или предотвращения возможных его нарушений является применение бактерийных препаратов, основным компонентом которых должны быть микробы, антагонистически действующие в отношении нежелательной, условно-патогенной микрофлоры. Такие препараты, используемые в целях бактериотерапии, применяются довольно широко. В то же время у различных видов животных и птицы циркулируют характерные для данных субъектов пробиотические микроорганизмы, и не всегда использование препаратов, сконструированных на основе бактерий, выделенных от одного вида животных эффективно при применении у других видов [9; 14].

Существующие методы определения антагонистической активности молочнокислых и других бактерий можно разделить на две группы: методы in vitro и in vivo. В первой группе применяемых методик штамм-антагонист и тест-культура взаимодействуют в искусственных условиях внешней среды, а во второй — непосредственно в тех естественных условиях, в которых планируется эксплуатировать предполагаемый штамм-антагонист. Методы in vitro позволяют быстро проверить большой массив штаммов молочнокислых бактерий и тест-культур нежелательных микроорганизмов (санитарно-показательных, патогенных или технически вредных). К данной группе относятся диффузионные методы и методы тестирования в жидких питательных средах. Первые (методы лунок, блоков, перпендикулярных штрихов, капель и т. п.) основаны на диффузии антибиотиков, образуемых испытуемыми штаммами лакто- и других бактерий, в толщу агаровой среды, содержащей тест-культуру, и подавлении роста последней.

Материалы иметоды исследований. Объектами исследований являлись лактобактерии — Lactobacillus agilis, Lactobacillus intermedius и Lactobacillus salivarius, которые независимыми микробиологическим методом, методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и метагеномными методами были выделены из слепых отростков желудочно-кишечного тракта перепелов [5].

Антагонистичскую активность выделенных культур лактобацилл определяли in vitro диффузионными методами: методом лунок, перпендикулярных штрихов и капель в различных модификациях по отношению к тест-культурам: Salmonella enterica subsp. enterica, выделенной от кур-несушек на Новороссийской птицефабрике; Staphylococcus aureus, выделенной от цыплят-бройлеров на Приморской птицефабрике Приморско-Ахтарского района; Escherichia coli А-20/О₁₃₇, выделенной от кур-несушек на Новомышастовской птицефабрике Красноармейского района.

Результаты исследований иих обсуждение. Поскольку метод перпендикулярных штрихов имеет существенный недостаток (продуцент антибиотического вещества и тест-организм выращивают на одной среде, но не всегда одна и та же среда одинаково благоприятна как для продуцента и образования им антибиотика, так и для роста тест-организма), при тестировании антагонистической активности лактобацилл этим методом мы использовали модификацию, при которой на чашку со средой для культивирования засевали экспоненциальную культуру исследуемого штамма лактобацилл и культивировали при температуре 38 °С в течение 48 ч, затем в условиях стерильности убирали половину чашки питательной среды, заливали АГВ, после застывания которого перпендикулярно от края чашки к штриху выросшей культуры лактобацилл подсевали штрихом суточные экспоненциальные культуры тест-штаммов. Чашку вновь инкубировали при тех же условиях в течение 24 ч. О наличии и степени антагонистической активности у испытуемых культур лактобацилл судили по величине зоны ингибирования тест-штамма на границе со штрихом роста.

Для объективной оценки антагонистического действия лактобактерий и других микроорганизмов, выявляемого этим методом, необходимо учитывать, что он дает преимущество штаммам, которые продуцируют ингибиторные соединения небольшой молекулярной массы, быстрее диффундирующие в толщу агарового слоя и, следовательно, дающие более обширные зоны ингибирования роста тест-культуры.

Для более объективной оценки антагонистической активности пробиотических культур использовали метод лунок. В слое агара, засеянного тест-штаммом, пробочным сверлом вырезали лунки диаметром 6 мм, в которые помещали тестируемые культуры лактобацилл в концентрации 10 ⁹ микробных клеток. Засеянную чашку Петри выдерживали при температуре 4 °С в течении 30 мин, затем в термостате при температуре 38 °С в течении 1824 ч, далее измеряли зону ингибирования роста тест-штамма вокруг лунки.

При дифференцировании продукции бактериоцинов (высокая молекулярная масса) и микроцинов (низкая молекулярная масса) использовали метод агаровых слоев. На поверхность плотной питательной среды для лактобацилл наносили бляшками (4–8) 48-часовые культуры лактобацилл и культивировали при температуре 38 °С в течение 24 и 48 ч. Далее на крышку чашки наносили 5 мл раствора хлороформа, оставляя чашки перевернутыми в течение 5 мин. Убитые в его парах бактерии помещали в термостат на 30 мин для испарения химического соединения. Затем на чашки наслаивали 0,7 % полужидкий мясо-пептонный агар с равномерно распределенной в нем тест-культурой и вновь культивировали при 38 °С в течение ночи. Положительный результат учитывали по появлению вокруг бляшки зоны отсутствия роста для культур, продуцирующих бактериоцины.

При определении антагонистической активности методом капель на поверхность подсушенной агаровой среды наносили капли культур лактобацилл и после инкубации чашек Петри при 38 °С в течение 2448 ч (для роста тестируемых бактерий и продуцирования ими ингибиторных веществ) сверху агара наливали слой полужидкой агаровой среды, содержащей тест-штамм в концентрации 10⁵/см³, и вновь инкубировали до появления зон ингибирования роста тест-штамма — 1824 ч.

При изучении антагонистической активности выделенных от перепелов культур лактобацилл, три штамма ингибировали рост тест-культур в пределах 25 мм, причем, при использовании метода перпендикулярных штрихов, зоны ингибирования роста выявлено не было, метода лунок — 23 мм, метода агаровых слоев — 25 мм. Наиболее чувствительной были культуры S. enterica subsp. enteric (зоны задержки роста 3 и 7 мм), и E. coli А-20/О₁₃₇ (зоны задержки роста 3 и 6 мм).

Вывод. Таким образом, для производства пробиотической добавки выделенные культуры лактобацилл (Lb. salivarius, Lb. intermedius и Lb. agilis)  перспективны.

Литература:

1. Антибактериальная активность микроводоросли / Ю. А. Лысенко, Н. Л. Мачнева, В. В. Борисенко, В. И. Николаенко // Молодой ученый. — 2015. — № 5–1 (85). — С. 17–20.

2. Биохимические и микробиологические аспекты получения биопродуктов и фармпрепаратов и эффективность их применения в птицеводстве / А. И. Петенко, С. Б. Хусид, И. С. Жолобова, Г. А. Плутахин, Ю. А. Лысенко, А. Г. Кощаев // Труды Кубанского государственного аграрного университета. — 2015. –№ 52. — С. 212–218.

3. Интенсификация птицеводства с применением пробиотических кормовых добавок / Ю. А. Лысенко, Т. М. Шуваева, В. В. Радченко, Е. В. Ильницкая, А. Г. Кощаев // Ветеринария Кубани. — 2015. — № 5. — С. 7–10.

4. Кощаев А. Г. Пробиотик трилактобакт в кормлении перепелов / А. Г. Кощаев, О. В. Кощаева, С. А. Калюжный // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. — 2014. — № 95. — С. 633‒647.

5. Метагеномное профилирование бактериозеноза пищеварительного тракта различных линий перепелов / Е. Р. Кириллова, Т. В. Григорьева, М. Н. Синягина и др. // Материалы всероссийской конференции с международным участием, посвященная 40-летию кафедры генетики Института фундаментальной медицины и биологии Казанского университета. — Казань. — 2016. — С. 5556.

6. Мигина Е. И. Изучение токсикологического и раздражающего действия пробиотической кормовой добавки Трилактосорб для использования в перепеловодстве / Е. И. Мигина, Ю. А. Лысенко, А. Г. Кощаев // Ветеринария Кубани. — 2014. –№ 4. — С. 13‒16.

7. Пробиотическая кормовая добавка в кормлении перепелов / А. Г. Кощаев, Ю. А. Лысенко, А. В. Лунева, А. В. Лихоман // Зоотехния. — 2015. — № 10. –С. 4–6.

8. Продуктивность и мясные качества перепелов при использовании пробиотической кормовой добавки / А. Г. Кощаев, Г. В. Фисенко, Ю. А. Лысенко, Г. А. Плутахин, Т. М. Шуваева, Е. В. Ильницкая, А. С. Родионова // Аграрная наука. — 2015. — № 11. — С. 15–18.

9. Фармакологическое и токсикологическое действие пробиотической кормовой добавки, используемой в кормлении птицы / Ю. А. Лысенко, Г. В. Фисенко, А. С. Родионова, В. В. Радченко, А. Г. Кощаев // Зоотехния. — 2015. — № 12. –С. 17–18.

10. Фармакологическое обоснование использования жидкого пробиотика на основе молочнокислой и пропионовокислой микрофлоры в перепеловодстве / Ю. А. Лысенко, Г. В. Фисенко, А. В. Лихоман, Т. М. Шуваева, В. В. Радченко, А. Г. Кощаев // Ветеринария Кубани. — 2015. — № 6. — С. 6–8.

11. Хлорелла и триходерма в качестве функциональных кормовых добавок перепелам / А. Г. Кощаев, А. И. Петенко, Г. А. Плутахин, Н. Л. Мачнева, Г. В. Фисенко, И. В. Пятиконов // Аграрная наука. — 2012. — № 7. — С. 28‒29.

12. Koshchaev A. G. Peculiarities of formation of the charolais cattle gene pool in the south of Russia / A. G. Koshchaev, I. V. Shchukina, O. V. Koshchaeva // Advances in agricultural and biological sciences. — 2016. — V. 2. — № 3. — P. 23‒32.

13. Koshchayev A. G. Perspectives of use a polystrain feed probiotic in poultry / A. G. Koshchayev, Y. A. Lysenko, O. V. Koshchayeva // Advances in Agricultural and Biological Sciences. — 2015. — V. 1. — № 2. — P. 44‒52.

14. Kuzminova E. V. Influence of the carotenoid-based preparations on the metabolic and antioxidant protection of the cows’ body / E. V. Kuzminova, M. P. Semenenko, A. G. Koshchaev // Advances in agricultural and biological sciences. — 2015. — V. 1. — № 3. — P. 33‒40.