В данной статье рассматриваются методы, позволяющие разрабатывать более оптимальные термоблоки амплификаторов, при их меньшей себестоимости.
Ключевые слова: ПЦР, АМПЛИФИКАТОР, ДНК, РНК
Большинство термоциклеров, присутствующих на рынке сегодня работают по следующему принципу: основой является алюминиевый или серебряный термоблок на 48 или 96 пробирок, под которым располагаются модули пельтье, установленные, в свою очередь на радиатор. На самом ПЦР блоке установлены термодатчики (в большинстве случаев NTC термисторы). Программа в микроконтроллере, изменяя подаваемую мощность на модули пельтье (методом ШИМ) и считывая показания с датчиков, регулирует температуру.
Поскольку для многих пользователей вопрос скорости проведения анализа является решающими при выборе прибора, многие производители снимают “лишний” материал, что приводит к суммарному уменьшению теплоемкости, ПЦР блок приобретает примерно такой вид:
Рис 1. Вид 3D модели ПЦР блока
Рис 2. Вид готового изделия (фрезеровка на MDX-40)
Данный путь, при высокой мощности используемых модулей пельтье ведет к неравномерному нагреву, и по результатам симуляции и практических тестов дисбаланс температуры в разных участках может доходить до нескольких градусов.
Важно понимать, что разрушение даже кратковременное превышение температуры 97C возможно разрушение даже термостабильной ДНК TAQ — полимеразы, что в свою очередь, приведет к ложноотрицательному результату.
Один из вариантов решения данной проблемы является изготовление термоблока с конденсационным теплообменником (такой же принцип используется в тепловых трубках, теплопроводность которых может в сотни раз превышать теплопроводность металлов). Между модулями пельтье и самим блоком создается полость, которая заполняется медной ватой и водой. Далее, в специальной камере для вакуммирования запаивается снизу модуль пельтье. В результате, при использовании данного метода, из-за переноса тепла конвекционным методом, удается достичь однородности температуры в 0.05C на термоблоке 4x4 см.
Рис. 3. ПЦР термос и блок с конденсационным термораспределением
Данная технология хорошо показала себя на прототипах небольших амплификаторов и ее рекомендуется использовать при производстве приборов на 10–20 проб. Самым очевидным недостатком данного метода являются трудности при проектировании блоков, где необходимо создавать температурный градиент.
Вторым способом стабилизации температуры является фрезеровка или печать на 3D принтере специального термоса из метериала с низкой теплопроводностью (например, из тефлона или ABS пластика).
Наиболее хорошие результаты при использовании термоса были получены при применении термоблока с конвекционным термораспределнием и алгоритмами управления снижающих скорость нагрева при небольшой разнице до заданной температуры.
Третьим методом оптимизации является роторное термостатирование. Его принцип состоит в том, что три разных термоблока нагреваются до температур денатурации, элонгации и терминации соответственно, а пробирки переставляются из блока в блок специальным механизмом в автоматическом режиме. Данную концепцию, широко применяемую, на стадии становления ПЦР анализов можно доработать, сделав обратно совместимой со стандартными 96 луночными ПЦР стрипами.
Рис. 4. Возможный вид термоблока роторного амплификатора (рэндеринг)
Преимуществом такого блока является широкий набор режимов эксплуатации
1) Возможность постановки анализа по роторному принципу: каждый из трех блоков имеет разную температуру, пробирки переставляются специальным механизмом, скорость нагрева и охлаждения ограничивается только теплопроводностью пробирок и составляет десятки градусов в секунду
2) Возможность выполнения трех разных программ (включая программы с градиентом) — “классический” вариант постановки ПЦР — каждая в своем блоке, т.е три разных эксперимента одновременно.
3) Возможность синхронного выполнения программы синхронно на трех разных блоках и работа с 96 луночными стрипами.
Заключение
В данной статье были рассмотрены как широкоизвестные, так и авторские методы стабилизации и достижения однородности температуры при производстве ПЦР термоциклеров. В результате было создано два экспериментальных аплификатора, характеристики термоблоков которых близки к промышленным аналогам, а в чем то и превосходят их.
Рис 5. Прототипы в сборе
Литература:
- Стерлинг Дж. Д. “Техническое руководство по волоконной оптике”,
- Ребриков Д. В. “ПЦР в реальном времени”, Издательство: БИНОМ, 2009 г
- Скрябин В. И. “Курс лекций по теплотехнике”.
- Сворень Р. А. “Электроника шаг за шагом”, Издательство: Горячая линия — Телеком, 2001 г.
- Белов А. В. “Создаем устройства на микроконтроллерах AVR”
