Применение аллозимного анализа в изучении генетического полиморфизма популяции Европейской Ряпушки (Coregonus albula) и ее устойчивости в Латвийском озере Дридзис

The use of allozyme analysis in the study of genetic polymorphism of the population of European vendace(Coregonus albula) and its stability in the Latvian lake Dridzis

Aims of research: To investigate morphological polymorphism of the population Coregonus albula under the following characteristics: weight, growth, age, sex, length. To investigate genetic polymorphism of the population of Coregonus albula based on allozyme polymorphism. The object of research: Vendace (Coregonus albula).

Methods of research: The statistic analysis of the morphological features of Coregonus albula, fiber electrophoresis, the analysis of the system of the isoferments.

In the review of the literature the common information on the main genetic processes in the population, about the factors of the stability influencing population genetic polymorphism of the population and survival rate is considered.

Special attention is given to the analysis protein polymorphisms using various systems of fermentation as in Latvia this problem is investigated not enough.

Key words: Coregonus albula, allozyme, polymorphism, vendace, morphological characteristics, Drīdzis Lake, isoferments, protein electrophoresis. 

Введение

Исследование популяции в условиях меняющейся среды - одна из важных задач, решение которой необходимо для понимания механизмов устойчивости биологических систем. Coregonus albula широко распространенный вид рыб, обитающий в основном в Северной Европе в восточной части. Считается, что данный вид рыбы появился в период обледенения. Начиная с 1900 года в Латвийские озера были интродуцированы особи с Чудского и Ладожского озер. В 30-ых годах 20 столетия Coregonus albula была зарегистрирована в 30 Латвийских озерах. [3,124-134] Однако в 90-ых годах данный вид Coregonus albula был констатирован уже только в 5 Латвийских озерах. В 2000 году указом Nr. 396—2000.14.11. кабинета министров Coregonus albula была занесена в список особо охраняемых видов рыб, и ограничили использование данного вида.

В наше время исследования популяции генофонда помогает оценивать и делать прогнозы относительно динамики развития популяции в пространстве и времени, а также определить допустимые границы корреляции количества особей. Это является первоочередной задачей в изучении популяционной генетики и является очень актуальным в наше время. В последние 10 лет исследования в области определения генетического полиморфизма в популяции достигли существенных успехов, в том числе в модернизации систем и методик исследования.

Материалы и методы

Для проведения данного исследования были отобраны 35 особей (Coregonus albula), отбор был произведен в озере Дридзис, в юго-восточной части озера. Для приготовления гомогената использовалась печень и мышечная ткань. Для сохранения белков, ткани были заморожены. При проведении эксперимента, ткани были разморожены и гомогенизированы с использованием 0,2 М Tris –HCl 1:2 (ткань/буфер). 10-20μ гомогената  бралось непосредственно для электрофореза. Для предотвращения деградации фермента и белков, приготовленный гомогенат хранился при температуре – 22 ْ⁰С  [13,72-90]. Также для проведения белкового электрофореза использовался полиакриламидный гель (PAAG). В данном эксперименте использовался вертикальный электрофорез. Для изготовления «карманов» применялась тефлоновая расческа (115х15х3 mm). Для разных систем использовались разные концентрации геля, в некоторых случаях, гель комбинировали (5% и 7%). Тефлоновая расческа вставлялась до затвердевания геля, затвердевание происходило в течение 15-20 минут после смешивания всех компонентов. После застывания геля, расческа удалялась, и в камеру электрофореза заливался буфер. Дальше происходила стадия преэлектрофореза 20 минут, далее происходила закладка исследуемого материала (гомогенат, сахароза, бромфенол синий). Далее процесс электрофореза происходил в три этапа (80V, 40mA) – 20 минут, (210V, 80mA) – 35 минут (80V, 40mA) – 20 минут. После электрофореза происходило окрашивание гелей соответствующими для каждой изоферментной системы красителями, далее термостатирование при 37 ْ⁰С. Спецификация ферментов отвечает нормам IUBNC. Во время анализа полученных полиакриламидных гелей (PAA) исследовалось разделение белковых фракций в электрофореграмме, основываясь на способность белков к электрофоретическим передвижениям в электрическом поле. Зоны действия фермента находились в соответствующем месте между катодом и анодом. Ближайшая к аноду зона обозначена  №1, остальные в порядке возрастания. Зоны белковых фракций были идентифицированы следующим способом: D– Less fast C– inter mediate B– slow moving A–more slow moving. Генетический контроль осуществлялся в соответствии с переносом изоэнзимов (определение локусов, разделения и переноса аллелей) были интерпретированы в соответствии с литературными сведениями [Vuorinem, 1984] и стандартных протоколов [Kaupinis, Paulauskas, Bukelskis, 2004]. Для визуализации белков были использованы следующие изоферментные системы: Lactate dehidrogenase (LDH, Ldh, E.C.1.1.1.27) катализирует обратное превращение лактата в пируват. У большинства позвоночных  LDH существует в 5 молекулярных формах, которые обозначают снижение электрофоретической активности. [Apella and Market 1961, Market 1961]. Malate dehydrogenase (MDH, Mdh, E. C. 1.1.1.37). Малатдегидрогеназа катализирует обратное превращение малата в оксалоацетата (L – малат + NAD⁺ = оксалоацетат +NAD *H). [Market and Faulhaber 1965]. Malic enzyme (ME, Me, E.C. 1.1.1.40) малик- энзим. SDH сорбиталдигидрогеназа (SDH, Sdh E.C.1.1.1.14) L - iditol, Nad- оксиредуктаза катализирует образование обратного D- сорбитала в D- фруктозе и связано с процессом обмена фруктозы [Кирпичников, 1987]. Peroxide dismutase (SOD_1,2, Sod, E.C.1.15.1.1) фермент- супероксидисмутаза реагирует на токсичные для клеток тканей радикалы супероксида, активные формы H₂O₂, O₂ [Kaupinis, Paulauskas, Bukelskis 2004]. Эстераза (EST, Est, E.C. 3.1.1.) ферменты, катализирующие в клетках гидролитическое расщепление сложных эфиров на спирты и кислоты при участии молекул воды. [13, 243].

Результаты и обсуждение

В системе Lactate dehidrogenase (LDH, Ldh, E.C.1.1.1.27) наблюдались 2 изофермента в зоне активности, которые кодировались в локусах LDH-1 и LDH-2, В локусе LDH-1 были констатированы 5 изоферментов в зоне активности у всех 35 особей. Это дает возможность сделать вывод, что данный локус является мономорфным. В Локусе LDH-2 были констатированы 3 изофермента в зоне активности у всех 35 особей, соответственно можно сделать вывод, что локус является также мономорфным. В системе Malic enzyme (ME, Me, E.C. 1.1.1.40), по электрофореграмме  были определены 3 изофермента в зоне активности, локус мономорфный. В локусе ME–2 2 изофермента в зоне активности, локус полиморфный, но у ME–1 3 изофермента в зоне активности и свидетельствует о том, что  ME – 2 и ME – 1 полиморфные локусы. Peroxide dismutase (SOD, Sod, E.C.1.15.1.1). В SOD системе у всех образцов были замечены два изофермента в зоне активности, SOD-1 3 изофермента в зоне активности, локус полиморфный. SOD-2 1 изофермент в зоне активности, локус мономорфный. Malate dehydrogenase (MDH, Mdh, E. C. 1.1.1.37). В данной системе наблюдались 2 изофермента в зоне активности. MDH-1:  3 изофермента в зоне активности, локус полиморфный. MDH-2: 1 изофермент в зоне активности, локус мономорфный.

Основываясь на проведенный аллозимный анализ, исследование показало гетерозиготность по ряду аллелей, что кодируют белки ME, SOD, NAD, LDH. И  теперь мы можем сделать заключение, что на данном этапе развития популяции средний полиморфизм в популяции данной области был равен 44,4%, а полиморфизм, превышающий 40%, свидетельствует об устойчивости данной популяции Coregonus albula и можно предположить, что вымирание ей не грозит. Однако, с условием, что в ближайшее время не возрастет влияние антропогенного фактора.

Литература

1.         Bērziņš B., Dziļākais Latvijas ezers (Drīdzis). Daba un zinātne, №3. 1940.

2.         Eipurs I., Mūsu saldūdeņu zivis. 1984.

3.         Glazačeva L., Latvijas ezeri un ūdenskrātuves.- Jelgava. 2004.

4.         Kundziņš M. Ezeru zemē, Rīgā, Zinātne. 1965.

5.         Kundziņš M., Andrušaitis G. Latvijas ezeri, Rīgā, Liesma. 1973.

6.         Liepa I., Mauriņš A., Vimba E. Ekoloģija un Dabas aizsardzība, Rīgā, Zvaigzne. 1991.

7.         Lobašovs M., Ģenētika, Rīgā, Zvaigzne. 1969.

8.         Misiņa M., Loža V. Ģenētika ar selekcijas pamatiem, Rīgā, Zvaigzne. 1991.

9.         Plikšs M., Aleksejevs Ē. Zivis, Gandrs. 1998.

10.     Raipulis J. Ģenētikas pamati, Tālmācības līdzeklis, Rīgā, RaKa. 2002.

11.     Sprūžs J. Dīķsaimniecība. Zivis un vēži: mācību grāmata.- Jelgava. 2005.

12.     Акайзин Е.О., Воскун С. Е., Панова Л. А., Смирнов С. Г. Микробиология. 1990.

13.     Анисимова А.А. Основы биохимии, Высшая школа. 1986.

14.     Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Москва, Мир, т. 3. 1994.

15.     Алиханян С. И., Акифьев А. П. Общая генетика, Москва, Высшая школа. 1985.

16.     Алтухов Ю. П. Об иммуногенетическом подходе к проблеме внутривидовой дифференциации у рыб // Успех современной генетики. 1969.

17.     Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. Москва, Академия наук. 2003.

18.     Гиляров А.М., Популяционная экология, Издательство Московского Университета, − 1990. − С126−141.

19.     Потапова О.И. Крупная ряпушка Coregonus albula L. Ленинград: Наука. 1978.

20.     Решетников Ю.С. Экология и систематика сиговых рыб. Москва: Наука. 1980.

21.     Страйер Л. Биохимия. Москва, т. 1-3. 1984.