По отношению к цитидину и атипичному нуклеозиду гемцитабину, использование раствора гемцитабина для изучения активности фермента целесообразно.
Ключевые слова: цитидиндезаминаза, цитидин, гемцитабин.
Актуальность. Цитидиндезаминаза является индуктором соматических гипермутаций генов иммуноглобулинов [1]. Соматические гипермутации — это один из базовых механизмов формирования разнообразия антигенраспознающих структур иммунокомпетентных клеток [2]. Фермент обладает прямой антиретровирусной активностью при условии высокого внутриклеточного содержания рибонуклеопротеидов и свободной РНКазы [3], участвует в процессах репарации ДНК и биодеградации свободных нуклеотидов, задействован в метаболизме аминокислот. Недостаточность системы, индуцирующей соматические гипермутации, приводит к иммунодефицитам различной степени выраженности [3]. Среди методов изучения активности фермента цитидиндезаминазы значительный удельный вес по-прежнему занимают биохимические спектрофотометрические и колориметрические тесты. Индофенольная колориметрическая реакция, где в качестве субстрата используются растворы нуклеозидов, экономически выгодна и достаточно наглядно отражает уровень активности ЦДА в сыворотке крови. Потому стандартизация и повышение точности данного метода исследования может быть полезна для внедрения его в клиническую практику.
Цель: сравнение активности фермента цитидиндезаминазы по отношению к цитидину и гемцитабину.
Материалы иметоды. Растворы цитидина и гемцитабина в концентрации 21 мМоль/л, фенольно-нитропруссидный раствор — 106 мМоль/л, растворы нитропруссида натрия — 50 мг/л и 200 мг/л, раствор гипохлорита натрия в концентрации 11 ммоль/л. Сыворотки крови от 10 здоровых добровольцев. Активность цитидиндезаминазы измерялась в индофенольной колориметрической реакции по методике Giutsi со следующим соотношением реакционных компонентов: 200 мкл субстратного раствора: 20 мкл исследуемой сыворотки: 600 мкл фенольно-нитропруссидного раствора: 600 мкл основного раствора гипохлорита натрия. Инкубация проводилась при 37°C в пробирке типа Эппендорф объемом 1,5 мл в течение 22 часов. Для учета результатов использован 96-луночный планшет, иммуноферментный анализатор-мультискан. Обработка полученных данных произведена с помощью программы Microsoft Excel 2010.
Результаты работы. Цитидиндезаминаза активна в отношении большого количества минорных нуклеозидов и нуклеозидоподобных соединений [14]. Находящаяся на вершине фенольного кольца — NH2 — группа может относительно легко отрываться как в случае цитидина, так и в случае гемцитабина, что позволяет использовать раствор гемцитабина в качестве субстратного раствора при проведении индофенольной колориметрической реакции.
Основная проблема в исследованиях активности цитидиндезаминазы в плазме связана со стандартизацией нормальных показателей ферментативной активности. Есть две тенденции в интерпретации сывороточной активности цитидиндезаминазы: первая постулирует активность данного фермента как вариабельный признак, характеризующийся высокой степенью спонтанных колебаний; вторая тенденция связана с тем, что активность цитидиндезаминазы в плазме характеризуется крайне низким уровнем и любое значительное повышение имеет высокую диагностическую значимость. Выделение из общей группы здоровых добровольцев лиц только мужского пола от восемнадцати до двадцати пяти лет делалось с целью ввести оптимальный уровень активности ЦДА.
По результатам исследования значения активности ЦДА в отношении цитидина и гемцитабина сопоставимы (таблица 1).
Таблица 1
Оптическая плотность растворов после инкубации иактивность ЦДА вреакциях дезаминирования цитидина игемцитабина
|
Номер образца |
Показатели оптической плотности после реакции сцитидином |
Активность вреакции сраствором цитидина, МЕ/л |
Показатели оптической плотности после реакции сгемцитабином |
Активность вреакции сраствором гемцитабина, МЕ/л |
|
1 |
0,094 |
0,34 |
0,144 |
0,63 |
|
2 |
0,103 |
0,58 |
0,122 |
0,84 |
|
3 |
0,101 |
0, 53 |
0,117 |
0,71 |
|
4 |
0,107 |
0,69 |
0,155 |
1,72 |
|
5 |
0,105 |
0,63 |
0,133 |
1,14 |
|
6 |
0,089 |
0,21 |
0,095 |
0,13 |
|
7 |
0,104 |
0,61 |
0,118 |
0,74 |
|
8 |
0,102 |
0,55 |
0,106 |
0,42 |
|
9 |
0,107 |
0,69 |
0,102 |
0,32 |
|
10 |
0,092 |
0,53 |
0,091 |
0,73 |
|
Среднее значение, (M±m) |
0,10±0,02 |
0,54±0,05 |
0,12±0,01 |
0,74±0,14 |
Показатели оптической плотности при реакции с гемцитабином достоверно отличаются от таковых со стандартным раствором цитидина (p<0,05). Показатели оптической плотности в индофенольной колориметрической реакции после 22-ти часовой инкубации для цитидина и гемцитабина показали слабую положительную корреляцию с коэффициентом регрессии R=0,64, что может быть объяснено малым объемом выборки (рисунок 1).
Рис.1. Связь между значениями оптической плотности в индофенольной колориметрической реакции при использовании цитидина и гемцитабина в качестве субстратов
Выводы
- Использование атипичного нуклеозида — гемцитабина — целесообразно для определения активности цитидиндезаминазы.
Литература:
- Дашкевич, А. М. Безопасность и эффективность вакцины «Флюваксин» при иммунизации военнослужащих / А. М. Дашкевич и др. // Здравоохранение, 2011. –2011. — № 12 — C. 36–40.
- Павлов, К. И. Цитидиндезаминаза и аденозиндезаминаза — ферменты, контролирующие интенсивность и специфичность иммунного ответа: стандартизация активности в норме и диагностическая значимость при заболеваниях / К. И. Павлов, Л. П. Титов, А. Е. Гончаров, О. А. Янович, С. В. Жаворонок // Медицинский журнал — 2014. — № 4.
- Selection of the best blood compartment to measure cytidine deaminase activity to stratify for optimal gemcitabine or cytarabine treatment / G. J.Peters, R. J. Honeywell, M. Maulandi // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids–2014 — № 33 — C. 403–412.
