С момента зарождения секвенирования в 1970-х некоторые методы вымерли, а некоторые эволюционировали и сегодня стали методами, которые выбирают многие исследователи, стремящиеся понять генетические вариации.
Секвенирование по Сэнгеру
Секвенирование по Сэнгеру применяется при проведении низкопроизводительного, целевого или короткого секвенирования. Благодаря своей чувствительности и относительной простоте в плане рабочего процесса и техники, данная методика остается золотым стандартом в технологии секвенирования и используется в различных областях, от целевого секвенирования до подтверждения вариантов, выявленных ортогональными методами.
В секвенировании по Сэнгеру используется метод терминации цепи для определения идентичности и порядка нуклеотидных оснований в данной нити ДНК. В этом методе используются химические аналоги четырех нуклеотидных оснований. В этих аналогах, называемых дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP), отсутствует гидроксильная группа, необходимая для удлинения полинуклеотидных цепей, образующих молекулу ДНК. При смешивании радиоактивно-меченых дидезоксинуклеозидтрифосфатов с шаблонной ДНК образуются нити любой возможной длины, в которых меченые ddNTP встраиваются и завершают цепь.
К середине 1990-х годов исследователи проводили секвенирование по Сэнгеру с помощью капиллярного электрофореза. В этой технологии меченые фрагменты ДНК разделяются по размеру в длинных тонких капиллярах из акрилового волокна, заполненных гелевой матрицей. Образец, содержащий меченые фрагменты, электрокинетически вводится в капилляр, и движется под действием электрического поля. Проходя через детекторующий лазер внутри прибора, метки обнаруживаются, и последовательность определяется. Одним из самых популярных приборов для секвенирования по Сэнгеру сегодня является генетический анализатор Applied Biosystems 3500.
Капиллярный электрофорез и фрагментный анализ
Приборы для капиллярного электрофореза (КЭ) способны выполнять как секвенирование по Сэнгеру, так и фрагментный анализ. Фрагментный анализ - это метод, при котором фрагменты ДНК флуоресцентно маркируются, разделяются с помощью КЭ и определяются по размеру путем сравнения с внутренним стандартом. Хотя секвенирование ДНК с помощью КЭ используется для определения конкретной последовательности оснований определенного фрагмента или сегмента гена, этот метод также позволяет получить размер, относительное количество и информацию о генотипировании для флуоресцентно меченых фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР с использованием праймеров, предназначенных для конкретной ДНК-мишени.
Анализ фрагментов ДНК позволяет решать различные задачи - от аутентификации клеточных линий до выявления анеуплоидии. Хотя методы секвенирования также позволяют решать эти задачи, исследователи выбирают фрагментный анализ, поскольку он имеет более быстрое время выполнения, более высокую чувствительность и разрешение, а также является более экономичным.
Секвенирование следующего поколения (NGS)
Хотя за прошедшие годы в секвенирование по Сэнгеру был внесен ряд усовершенствований, появились и новые высокопроизводительные методы, получившие название технологий секвенирования следующего поколения (NGS). NGS проводится в массивно-параллельном режиме.
Спектр анализа NGS может простираться от небольшого количества генов до целого генома, в зависимости от цели. Цельногеномное секвенирование (WGS) и цельноэкзомное секвенирование (WES) позволяют получить последовательность оснований ДНК в геноме и экзоме соответственно. Секвенирование цельного транскриптома предоставляет информацию о последовательности кодирующих и многочисленных некодирующих форм РНК для оценки вариаций и уровней экспрессии генов во всем транскриптоме. Целевое секвенирование охватывает относительно небольшой набор генов или целевых регионов, представляющих интерес. Быстрое время выполнения, низкая стоимость, низкая потребность в образцах и относительная простота интерпретации делают целевое секвенирование особенно подходящим для трансляционных и клинических исследований. Для подтверждения вариантов, выявленных с помощью NGS, часто используется секвенирование по методу Сэнгера.
Секвенирование по Сэнгеру, фрагментный анализ и NGS позволяют использовать множество новейших технологий, которые способствуют углублению научного понимания геномов.
По материалам сайта www.laboratorii.com
