Поиск и выделение активных штаммов деструкторов нефти и нефтепродуктов из нефтезагрязненных почв



В ходе исследований были изучены микрофлора нефтезагрязненных почв и было отражено отрицательное воздействие нефти и нефтепродуктов на численность почвенных микроорганизмов. Были выделены и изучены бактериальные штаммы, обладающие способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов, что делает их перспективными агентами для ликвидации нефтяного загрязнения почв в условиях данного региона.

Ключевые слова: нефтезагрязненные почвы, монокультуры, деструкторы нефти

During the research, the microflora of oil-contaminated soils was studied and the negative impact of oil and petroleum products on the number of soil microorganisms was reflected. Bacterial strains with the ability to destroy oil and petroleum products have been identified and studied, which makes them promising agents for the elimination of oil pollution of soils in the conditions of this region.

Key words: oil contaminated soils, monocultures, oil destructors

Процессы добычи нефти и производства нефтепродуктов, их транспорт и хранение неизбежно связаны со значительными потерями. Попадая в окружающую среду, углеводороды нефти оказывают угнетающее действие на экологические системы: губят живые организмы и существенно изменяют условии их обитания. Естественные процессы восстановления природных систем после нефтяного загрязнения продолжительны по времени. Существующие механические, термические и физикохимические методы очистки почв от нефтяных загрязнений дороги и эффективны лишь при определенном уровне загрязнения [1].

Характерной особенностью нефти как совокупности различных углеводородов является то, что, попадая в почву или водную среду, она разрушается, поскольку составляющие ее углеводороды подвержены вымыванию, выветриванию, частичному химическому окислению и микробному разрушению [1].

Среди мер, предпринимаемых с целью охраны окружающей среды от указанного типа загрязнений, наиболее перспективным и экологически безопасным является метод биоремедиации почв, основанный на способности некоторых микроорганизмов к деградации нефти и нефтепродуктов [2,3,4,5].

Микробиологическая рекультивация загрязненных нефтью почв основывается на двух подходах: активизации аборигенной микрофлоры почвы или интродукции адаптированных к загрязнителю и условиям внешней среды штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов [1].

Загрязнение биоценоза нефтью и нефтепродуктами вносит дополнительный источник углерода в экосистему, что стимулирует развитие данной группы бактерий [6], поэтому в хронически загрязненных экосистемах, численность углеводородокисляющих бактерий всегда выше по сравнению с не загрязненными, однако количественная связь между численностью углеводородокисляющих бактерий и количеством углеводородов в среде отсутствует [7].

Основной вклад в процесс микробиологического разрушения углеводородов вносят микроорганизмы, способные использовать нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии. Такие микроорганизмы встречаются, главным образом, среди аэробных форм, они получили название «углеводородокисляющие микроорганизмы» [8,9,10].

Целью данной работы являлось поиск, выделение и скрининг активных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.

В работе были использованы 6 образцов почв, отобранные из нефтезагрязненных территорий нефтеперерабатывающего завода (АНПЗ) и пропарочно-промывочной станции вагонов (АППС) Ферганской области республики Узбекистан. Образцы почв отбирались по методике описанному в руководстве Д. Г. Звягинцева (1991) [11]. После отбора образцов почв были проведены микробиологические исследования

Численность аммонифицирующих и фосформобилизующих бактерий определяли методом предельных разведений на элективных питательных средах: аммонифицирующие — на РПА, фосформобилизующие на среде Пиковской, олигонитрофилов — на среде Эшби, актиномицетов и микромицетов — на среде Чапека. Выделение монокультур из образцов нефтезагрязненных почв, проводили по общепринятым в почвенной микробиологии методам. Изучение способности выделенных штаммов аммонифицирующих (АМ) бактерий, к деградации смолистых веществ нефти (нефтяной пленки) проводили по методу, описанному в руководстве Д. Г. Звягинцева (1991) [11].

Питательную среду (пептонная вода+глюкоза+ NaCl) в колбочках с 30 мл засевали каждой из изучаемых монокультур, сверху заливали 1 мл (2 %) нефти. Культивирование проводили на качалке при 120 об/мин при 28⁰С в течение 30 суток. Деструкционную способность культур определяли визуально по убыли нефти на поверхности среды, отбирая таким образом активные культуры.

На первом этапе исследований было изучено содержание аммонификаторов, олигонитрофилов, фосформобилизующих микроорганизмы, микромицетов и актиномицетов в исследуемых почвенных образцах (Таблица 1). Из представленных данных видно, что аммонифицирующие бактерии и олигонитрофилы были обнаружены во всех исследованных образцах, в отличии от фосформобилизующих бактерий, актиномицетов и микромицетов. В среднем количество олигонитрофилов составило lg 8,15 КОЕ/г почвы, аммонификаторов lg 7,17 КОЕ/гр, актиномицетов lg 6,67 КОЕ/г. В результате изучения микробного сообщества нефтезагрязненных почв Ферганского нефтеперерабатывающего завода, обнаружено что, нефтепродукты оказывают негативное действие на содержание агрономически важных групп микроорганизмов.

Таблица 1

Численность микроорганизмов почв загрязненных нефтью инефтепродуктами, lg КОЕ/г

Образцы почв		Аммони-фикаторы	Фосфор-мобилизую-щие	Олиго-нитрофилы	Актино-мицеты	Микро-мицеты
Место отбора	Глубина отбора
«АНПЗ» 1	10 см	8,38	не обн	8,64	не обн	7,17
«АНПЗ» 1	20 см	8,68	не обн	8,67	не обн	не обн.
«АНПЗ» 2	10 см	7,57	не обн	8,62	6,67	не обн
«АНПЗ» 2	20 см	7,17	не обн	8,15	6,67	не обн
«АППС»	10 см	7,65	7,47	8,32	не обн	7,72
«АППС»	20 см	8,21	7,35	8,49	7,17	7,72

На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что 4 исследуемых образца из 6-ти были бедны фосформобилизующими микроорганизмами, что указывает на отрицательное воздействие нефти на их жизнедеятельность и слабое разложение фосфорсодержащих соединений. Это свидетельствует о том, что в нефтезагрязненном почве снижается активность фосфатазы, уменьшается содержание подвижного фосфора и тем самым нарушаются процессы гидролиза фосфорорганических соединений.

Из почвенных образцов были выделены 8 монокультур бактерий для их дальнейшего изучения на деструктивную активность по отношению к нефти и нефтепродуктам. При изучении морфологических свойств, активные углеводородокисляющие микроорганизмы были представлены в виде: круглых, треугольных колоний, с блестящей или матовой поверхностью светло и темно бурого, оранжевого, кремового цвета с ровными, складчатыми и лопастными краями. Размер колоний в среднем составляет 6–13 мм. По отношению к кислороду культуры относятся к аэробам и факультативным анаэробам (Таб.2).

Таблица 2

Морфология колоний выделенных монокультур

№штаммов	диаметр	поверхность	края	цвет	Отношение кО2
1-n	6 мм	выпуклая	ровные	светло-оранжевый	аэроб
2-n	13 мм	матовая	не ровные, складчато-лопастные	темно-бурый	аэроб
3-n	9 мм	блестящая	не ровные, лопастные	светло-бурый	аэроб
4-n	12 мм	матовая, складчатая	не ровные, складчато-лопастные	темно-бурый	аэроб
5-n	13 мм	блестящая	неровные	кремовый	аэроб
6-n	10 мм	матовая, складчатая	не ровные, лопастные	светло-бурый	аэроб
7-n	20 мм	матовая	не ровные, лопастные	светло-бурый -	аэроб
8-n	6 мм	матовая	не ровные, лопастные	светло-бурый -	аэроб

Далее нами исследована деструктивная способность чистых культур бактерий, выделенных из образцов. Всего в результате первичного скрининга отобрано 7 бактериальных культур:

‒ 4 культур — 1-n, 6-n, 7-n, и 8-n — разрушали нефтяную пленку на 50–80 %, образовывая суспензию;

‒ 3 культуры — 2-n,4-n,5-n — полностью разрушали нефтяную пленку- 100 % деструкция смолистых веществ нефти уже на 5-е сутки инкубации;

‒ 1 культура — 3-n не проявляла нефтедеструктивную способность;

из 8 культур — 7 культур — аммонифицирующие бактерии и 1 — фосформобилизующая.

Таблица 3

Качественное описание состояния культуральной суспензии штаммов снефтью на 25-е сутки инкубации

Штаммы	Форма раствора	Поверхность раствора	Цвет раствора	Степень разрушения нефтяной пленки
1-n	2-х фазная суспензия с хлопьями коричневого цвета	жирные разводы	светло-коричневый	80 %
2-n	эмульсия с черными хлопьями	жирные разводы	темно коричневый	100 %
3-n	прозрачная суспензия	нефтяная пленка	светло-желтый	0 %
4-n	эмульсия с черными хлопьями	жирные разводы	коричневый	100 %
5-n	эмульсия с черными хлопьями	жирные разводы	темно коричневый	100 %
6-n	2-х фазная мутная суспензия с мелкими хлопьями черного цвета	нефтяная пленка	темно-бурый	80 %
7-n	2-х фазная суспензия с хлопьями коричневого цвета	частичная нефтяная пленка	коричневый	50 %
8-n	2-х фазная суспензия с хлопьями черного цвета	частичная нефтяная пленка	коричневый	70 %

Заключение

Почвенные микроорганизмы являясь иммунной системой природных биоценозов протекающих в почве, обеспечивают резистентность к антропогенным загрязнениям, в том числе нефтяным. В результате проведенных иследований выявлено, что нефть и нефтепродукты отрицательно повлияли на жизнедеятельность почвенных микроорганизмов. Выжившие и адаптированные микроорганизмы могут быть потенцияальными деструкторами нефти и нефтепродуктов, о чем свидетельствуют данные качественного эксперимента на деструкцию нефти в культуральной суспензии выделенных монокультур. Таким образом, из выделенных изолятов было отобрано 3 монокультур показавшие активную деструкцию уже на 5 сутки опыта. Отобранные активные штаммы-деструкторы нефти будут использованы для дальнейших исследований по биоремедиации нефтезагрязненных почв.

Литература:

1. Э. Р. Бабаев, М. Э. Мовсумзаде. Преобразование нефти в процессе ее микробиологической деградации в почве // Башкирский химический журнал. 2009. Том 16. № 3, С. 80–87.
2. Вельков В. В. // Биотехнология.– 2001.– № 2.– С. 70.
3. Panicker G., Aislabie J., Saul D., Dei A. K //Polar Biology.– 2002.– V. 25, № 1.– P. 5.
4. Звягинцева И. С., Суровцева И. Г., Поглазова М. Н., Ивойлов В. С., Белов С. С.// Прикладная биохимия и микробиология.– 2001.– Т. 70,№ 3.– С. 321.
5. Белоусова Н. И., Барышникова А. М., Илкидченко А. Н. // Прикладная биохимия и микробиология.– 2002.– Т. 38, № 5.– С. 513.
6. Шамраев А. В., Шорина Т. С. Влияние нефти и нефтепродуктов на различные компонен-ты окружающей среды. Вестник ОГУ. 2009, 6: 642–645.
7. Atlas R. M. Microbial Hydrocarbon Degradation. Bioremediation of oil spills. J. Chem. Technol — Biotechenol. 1991, 52: 149–156
8. Израэль Ю. А., Цыбань А. В. Антропогенная экология океана. Л.: Гидрометеоиздат, 1989.
9. Кураков А. В., Ильинский В. В., Котелевцев С. В., и др. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях. М.: «Графикон», 2006.
10. Патин С. А. Экологические проблемы освоения нефтегазовых ресурсов морского шельфа. М.: Изд-во ВНИРО, 1997
11. Звягинцев Д. Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Москва.1991.225 с