Аутоантитела и метилирование ДНК у женщин с невынашиванием беременности



Установлено, что внутриутробное развитие плода прямо зависит от функционального состояния иммунной системы матери и регулируется, в частности, многими эмбриотропными антителами класса IgG [3, 6]. Эти антитела могут стимулировать рост и дифференцировку клеток-мишеней и выполнять множество других регуляторных функций [7].

Причиной изменений уровня содержания эмбриотропных антител у женщин с невынашиванием беременности чаще всего являются хронические инфекции (вирусные, урогенитальные), способные вызывать долговременные, стойкие изменения со стороны иммунной системы, и индуцировать как повышение, так и патологическое снижение продукции эмбриотропных антител [7]. Так у женщин с эмбриотропными аутоантителами IgG выявляются стойкие системные иммунные изменения, затрагивающие механизмы иммунорегуляции беременности, а у женщин с нормально протекающей беременностью не сопровождаются заметными системными нарушениями (вызывают лишь локальные изменения) [7].

У женщин, страдающих невынашиванием беременности, концентрация многих аутоантител выходит за границы физиологической нормы более чем в 90 % случаев [6].

Причиной повышения эмбриотропных аутоантител IgG и стойких системных иммунных изменений могут являться эпигенетические модификации, вызванные персистирующими инфекциями [7].

Согласно современным представлениям, под эпигенетическими процессами понимают наследуемые, стабильные, но потенциально обратимые изменения экспрессии генов, не связанные с нарушениями их нуклеотидной последовательности [1,4,5]. Метилирование является основным эпигенетическим модификатором генома, поскольку вовлечено в такие фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки, как регуляция экспрессии генов и поддержание стабильности генома [2, 10].

Гипометилирование может приводить к нестабильности хромосом, потере защиты от вредных рецессивных мутаций и, возможно, к глобальному снижению активности генома, что сказывается на клинической манифестации наблюдаемых больных. Если рассматривать метилирование ДНК как защитный механизм, который обеспечивает инактивацию паразитических последовательностей ДНК, таких как транспозоны и провирусные ДНК, то его нарушение может приводить к потере защиты от вредных рецессивных мутаций. Известен тот факт, что вирусные последовательности, попав в человеческие клетки, могут подвергаться метилированию, которое приводит к блокировке транскрипции и дальнейшей элиминации вируса. Возникают предположения, что роль метилирования ДНК как компонента клеточной системы, предназначенной для уничтожения чужой или излишней ДНК (или подавления ее функции) сохраняется, по-видимому, на протяжении всей жизни [8, 11].

Многие вирусы при инфицировании способны стимулировать повышение уровня экспрессии ДНК-метилтрансфераз клетки — хозяина (аденовирусы, герпесвирусы, папиломавирусы и пр.) [12].

Таким образом, можно предположить, что у женщин с невынашиванием беременности имеющих повышенное содержание эмбриотропных аутоантител IgG в крови и стойкие системные иммунные изменения может встречаться гипометилирование и снижение экспрессии ДНК-метилтрансфераз. Что представляло интерес для наших исследований.

Цель исследования: изучить метилирование ДНК, активность ДНК-метилтрансферазы 1 в лимфоцитах у женщин с невынашиванием беременности, имеющих повышенное содержание эмбриотропных аутоантител IgG в крови и стойкие системные иммунные изменения.

Материал иметоды. Обследованы 122 женщины, которые были разделены на 2 группы. В первую группу вошли 58 женщин, имевших от 1 до 4 полноценных беременностей, во вторую группу — 64 женщины, у которых в анамнезе было 2 и более самопроизвольных прерываний беременности.

Для исследования процессов метилирования ДНК отбирались женщины с наиболее выраженным аутоантителообразованием. Причем, учитывали наличие сочетания антител к тиреопероксидазе (АТ-ТП) и тиреоглобулину (АТ-ТГ), сочетанное наличие антител к двуспиральной ДНК (ds ДНК) и односпиральной ДНК (ss ДНК), и отдельно наличие аутоантител-cHSP60.

Учитываемые показатели определяли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартных тест-систем: антитела к АТ-ТП и АТ-ТГ — «ХЕМА-МЕДИКА» (Россия), антитела к ds ДНК и к ss ДНК, к cHSP60, а также общих иммуноглобулинов (Ig) A, M, G, провоспалительных — интерлейкин-1бета (ИЛ-1бета), фактор некроза опухолей-α (ФНО-α), и противовоспалительных — интерлейкин -10 (ИЛ-10) — «Вектор-Бест» (Россия).

Метилирование происходит в позиции C5 молекулы 2'-дезоксицитидина с образованием метилированного основания 5-метил-2'-дезоксицитидина. Поэтому глобальные изменения уровня метилирования ДНК могут быть определены количественно в плазме или моче, супернатантах клеточных культур и других биологических матриксов по концентрации 5-метил-2'-дезоксицитидина. В связи, с чем изменения уровня метилирования ДНК в супернатанте отмытых гемолизированных лимфоцитов, выделенных в фекол-верографине, определяли по концентрации 5-метил-2'-дезоксицитидина, используя метод ИФА (стандартный набор BCM Diagnostics, США). Активность ДНК-метилтрансферазы 1 определяли также в супернатанте отмытых гемолизированных лимфоцитов, выделенных в фекол-верографине, с использованием ИФА набора для определения (cytosine-5)-methyltransferase 1 (DNMT1) (стандартный набор Human, Германия).

Результаты иих обсуждение.

Установлено, что у женщин первой группы совместно антитела к тиреопероксидазе и тиреоглобулину встречались у 8 женщин, что составило 13,8±1,6 %, во второй группе эти антитела встречались у 19 женщин, что составило 29,7±3,2 % (P<0,001).

При исследовании уровня метилирования ДНК в супернатанте лимфоцитов у 8 женщин первой группы было выявлено, что средний показатель концентрации 5-метил-2'-дезоксицитидина составил 87,4±9,6нг/мл. А во второй группе (19 женщин) этот показатель составил 49,7±5,4 нг/мл (P<0,001), При этом у 8 женщин первой группы показатель активности ДНК-метилтрансферазы 1 в супернатанте лимфоцитов составлял 31,5±3,7 нМ/мл., а во второй группе (у 19 женщин) этот показатель был 18,1±2,6 нМ/мл (P<0,05).

Также было обнаружено, что у женщин первой группы совместно антитела к двуспиральной и односпиральной ДНК были выявлены у 6 женщин, что составило 10,3±1,2 % случаев. У женщин второй группы эти антитела выявлены в 17 случаях, что составило 26,6±2,4 % (P<0,001).

В тоже время проведенные исследования у 6 женщин первой группы имеющих совместно антитела к двуспиральной и односпиральной ДНК, показали, что уровень метилирования ДНК в супернатанте лимфоцитов составлял 72,8±8,1нг/мл. А во второй группе у 17 женщин при тех же условиях этот показатель составляла 41,8±5,2нг/мл (P<0,001), При этом, у 6 женщин первой группы показатель активности ДНК-метилтрансферазы 1 в супернатанте лимфоцитов составлял 22,5±3,1 нМ/мл, а во второй группе у 17 женщин этот показатель был 15,1±2,3 нМ/мл (P<0,5).

Аутоантитела-cHSP60 при исследовании в первой группе встречались у 9 женщин, что составило 15,5±1,8 % случаев, у женщин второй группы эти антитела встречались у 22 женщин, что составляло в 34,4±4,1 % случаев (P<0,001).

Уровень метилирования ДНК в супернатанте лимфоцитов у 9 женщин первой группы составлял 94,1±10,2нг/мл. А во второй группе у 22 женщин при тех же условиях этот показатель составлял 57,2±6,4нг/мл (P<0,001), При этом, у 9 женщин первой группы показатель активности ДНК-метилтрансферазы 1 в супернатанте лимфоцитов составлял 28,5±3,4 нМ/мл. а во второй группе у 22 женщин этот показатель был 21,3±2,6 нМ/мл (P<0,5).

С целью выявления стойких системных иммунных изменений у женщин обеих групп (58 и 64) исследовали про- и противовоспалительные интерлейкины, а также общие IgА, IgМ, IgG в сыворотке крови.

При обследовании женщин первой группы средний показатель провоспалительного интерлейкина ФНО-α составил 216,4±23,7 пг/мл, что было в пределах референсных значений, у женщин второй группы этот показатель был достоверно выше, по сравнению с первой группой, и составлял 392,1±42,5 пг/мл (Р<0,001), также был выше и референсных значений.

Средний показатель ИЛ-1 бета у женщин первой группы составлял 186,3±19,7 пг/мл, что было в пределах референсных значений. У женщин второй группы этот показатель по сравнению с первой группой был достоверно выше и составлял 345,8±37,2 пг/мл (Р<0,05), что также было выше референсных значений.

Результат средних значений ИЛ-10 у женщин первой группы составлял 438,6 ± 46,1 пг/мл, что было в пределах референсных значений. У женщин второй группы этот показатель был достоверно ниже по сравнению с первой группой и составлял 296,7±32,4 пг/мл (Р<0,001) что было также в пределах референсных значений.

При исследовании показателей гуморального иммунитета было установлено, что средние показатели общих IgА у женщин первой группы составляли 4,2±0,5 мг/мл. У женщин второй группы этот показатель был недостоверно ниже по сравнению с первой группой и составлял 3,1±0,4 пг/мл, оба показателя были в пределах референсных значений.

Средний показатель общих IgМ у женщин первой группы составлял 2,2±0,3 мг/мл, что было в пределах референсных значений. У женщин второй группы этот показатель был недостоверно выше по сравнению с первой группой и составлял 3,2±0,5 пг/мл, что было выше референсных значений.

В то же время средний показатель общих IgG у женщин первой группы составлял 16,2±1,8 мг/мл, что было в пределах референсных значений. У женщин второй группы этот показатель был достоверно выше, по сравнению с первой группой, и составлял 26,4±2,7 пг/мл (Р<0,001), что было выше референсных значений.

Из полученных данных видно, что у женщин с невынашиванием беременности показатели аутоантителообразования, оценивая по встречаемости аутоантител, выше по сравнению с женщинами, имеющими по 1–4 полноценные беременности. Также у женщин с невынашиванием беременности отмечаются выраженные нарушения иммунитета, проявляющиеся в увеличении провоспалительных и уменьшении противовоспалительных интерлейкинов, а также в выраженном повышении общих IgG. Кроме того, у женщин с невынашиванием беременности отмечается выраженное гипометилирование ДНК в лимфоцитах. При этом показатель активности ДНК-метилтрансферазы 1 в лимфоцитах у этих женщин при повышенных показателях аутоантител к ds ДНК, ss ДНК и cHSP60 существенно не менялся. Видимо гипометилирование ДНК, связано с нарушением общего метилирования у женщин с невынашиванием беременности. В тоже время показатель активности ДНК-метилтрансферазы 1 в лимфоцитах у женщин с невынашиванием беременности при повышенных показателях аутоантител к АТ-ТП и АТ-ТГ был достоверно ниже, что показывает на возможность локального гипометилирования лимфоцитов.

Полученные нами результаты исследования подтверждают предположение, что гипометилированные Т-лимфоциты приобретают способность индуцировать развитие аутоиммунных реакций [2]. При этом имеющиеся многочисленные данные свидетельствуют о тотальном гипометилировании CD4+ Т-клеток при СКВ у человека, скорее всего, в результате снижения активности ДНК метилтрансферазы-1 [9, 15].

Другое объяснение может заключаться в том, что неметилированный цитозин ДНК может стимулировать врожденные иммунные реакции, что потенциально приводит к аутоиммунным реакциям [2, 14, 8, 13].

Можно предположить, что гипометилирование ДНК является одной из основных предрасполагающих эпигенетических причин нарушения иммунитета и выработки эмбриотропных аутоантител у женщин с невынашиванием беременности. Так как у них снижена защита ДНК от вредоносного воздействия инфекционного и не инфекционного характера, которые являются пусковыми факторами в нарушении иммунитета и выработки эмбриотропных аутоантител у женщин с невынашиванием беременности.

ВЫВОДЫ: Уженщин с невынашиванием беременности, имеющих в крови эмбриотропные аутоантитела и нарушение иммунитета, одним из факторов способствующих этим нарушениям является гипометилирование ДНК, а пусковым механизмом могут являться инфекционные и не инфекционные факторы.

Литература:

1. Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика, 2006, Т.42, № 9, С.1186–1199.
2. Козлов В. А. Клеточный геном в патогенезе основных заболеваний человека (атеросклероз, аутоиммунные заболевания, рак) //Медицинская иммунология, 2010, Т.12, № 4–5.
3. Комиссаренко Ю. И., Бобрик М. И. Аутоиммунные нарушения при эндокринной патологии. Новый взгляд на диагностику и менеджмент// Международный эндокринологический журнал, 2016, № 4 (76), С. 41–44.
4. Назаренко С. А. Эволюционная биология. Материалы II Международной конференции «Проблема вида и видообразование». Томск: Томский государственный университет, 2002, Т.2, С.82–93.
5. Озолиня Л. А., Ефимов В. С., Абдулраб А. С., Смирнова Е. Н., Чеховская Д. А., Кашежева А. З. Гипергомоцистеинемия и акушерская патология // Российский вестник акушера-гинеколога, 2003, Т.3, № 4, С. 26–29.
6. Полетаев А. Б. Иммунофизиология и иммунопатология. — М.:Мед. Информ. Агентство, 2008, 205 с.
7. Полетаев А. Б. Иммунология беременности и эмбриотропные аутоантитела // Вестник «МЕДСИ», 2010, № 8, С. 38–44.
8. Bachmann MF, Kopf M, On the Role of Innate Immunity in Autoimmune Diseases// J. Exp. Med., 2001, Vol.193 (Page F47-F50)
9. Ballestar E., Esteller M., Richardson B. C. The epigenetic face of systemic lupus erythematosus // J. Immunol., 2006, Vol.176, N12, P.7143–7147.
10. Baranov V. S., Baranova E. V. Human genome, epigenetics of complex diseases, and personalized medicine //Biosphere, 2012, Т.4, № 1.
11. Eeg-Oloofsson O., Al-Zuhair A. G. H., Teebi A. S., Al-Essa M. M. N. Rett syndrome: Genetic clues based on mitochondrial changes in muscle // Amer. J. Med. Genet., 1989, № 32, Р. 142–144.
12. Hoelzer K., Shackelton L. A., Parrish C. R. Presence and role of cytosine methylation in DNA viruses of animals //Nucleic acids research, 2008, Т. 36, № 9, С.2825–2837.
13. Janoway California, Mejita r, Congenital immune recognition// Anna. Rev. Immunol., 2002, Vol. 20 (pp 197–216)
14. Krieg AM, The role for toll in autoimmunity// Native Immunol., 2002, Vol. 3 (pp 423–424).
15. Sekigawa I., Kawasaki M., Ogasawara H., Kaneda K., Kaneka H., Takasaki Y., Ogawa H. DNA methylation: its contribution to systemic lupus erythematosus // Clin. ExP. Med., 2006, Vol. 6, N 3, P.99–100.