Антибиотикорезистентность клинически значимых штаммов — глобальная проблема современной медицины. Одним из перспективных методов решения данной проблемы является литическое воздействие на мобильные генетические элементы (МГЭ). Осуществить данное воздействие возможно путём использования системы адаптивного иммунитета бактерий — CRISPR/Cas, побочным действием активности которой является разрушение МГЭ. Соответственно, увеличение активности CRISPR/Cas ведёт к снижению патогенности антибиотикорезистентности клетки-носителя.
Ключевые слова: CRISPR/Cas, Плазмиды, Антибиотикорезистентность, Мобильные генетические элементы.
Увеличение числа антибиотикорезистентных штаммов среди клинически значимых микроорганизмов, одна из важнейших глобальных проблем современной медицины.
Бесконтрольное применение антибактериальных средств на протяжении последних 60 лет сформировало благоприятные условия для выживания и размножения резистентных штаммов. К бесконтрольному применению относиться — использование препаратов широкого спектра действия, вместо узконаправленных препаратов. А также некорректный подбор дозировки и не соблюдение пациентами предписанного курса лечения ведёт к созданию в организме концентраций антибактериальных соединений ниже терапевтической дозы вследствие чего происходит отбор резистентных форм микроорганизмов.
Одним из механизмов, обеспечивающих повышение антибиотикорезистентности, является горизонтальный перенос генов при помощи мобильных генетических элементов [1].
Мобильные генетические элементы
Существуют различные механизмы приобретения антибиотикорезистентных свойств. При помощи повышения активности CRISPR/Cas системы, в перспективе возможно, повлиять на мобильные генетические элементы.
Мобильные генетические элементы (МГЭ) — последовательности ДНК, способные к перемещению внутри генома [2].
Среди МГЭ несколько классов:
- Транспозоны
- Плазмиды
- Бактериофаги
- Интроны второй группы
Транспозоны — это участки ДНК организмов, способные к транспозиции и размножению в пределах генома. Они способны перемещать гены детерминирующие антибиотико-резистентные свойства от плазмиды к хромосоме и наоборот. Так же известно, что могут перемещаться в пределах одного вида, а также попадать в новые виды и роды микроорганизмов, распространяя свойство резистентности между различными видами.
Плазмиды — Двухцепочечные кольцевые или линейные, способные к автономной репликации, генетические элементы. Плазмиды способны передаваться между бактериями во время конъюгации, или путём свободного захвата из окружающей среды. Часть плазмидов несёт гены, детерминирующие антибиотико-резистентные свойства.
Бактериофаги — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Существуют определённые штаммы, которые способны доставлять в бактерию — носитель хромосомально-ассоцированные или плазмидассоциированные гены резистентности.
Нарушение данного механизма приобретения антибактериальной резистентности одно из перспективных направлений в решении проблемы резистентности клинически значимых микроорганизмов к антибактериальным препаратам [2].
CRISPR/Cas система
В настоящее время в литературе, большое число статей посвящено системе адаптивного иммунитета бактерий и архей. А именно — CRISPR/Cas системой. Большая часть исследований освещает различные способы применения данной системы в рамках генной инженерии. Однако, перспектива использования данной системы, в целях снижения антибактериальной резистентности, в литературе достаточного рассмотрения не получила [3].
CRISPR/Cas система один из эволюционно сформированных механизмов позволяющих бактериальной клетке распознавать поступающую чужеродную генетическую информацию и предотвращать её транскрипцию.
CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) представляет собой семейство последовательностей, найденное в геноме большинства архей (~90 %) и бактерий (~40 %).
Локусы CRISPR обычно состоят из множества несмежных паллиндромных повторов разделённых участками вариабельных последовательностей, называемых спейсеры.
Спейсеры, по большей части, представляют собой сегменты захваченных чужеродных вирусных и плазмидных последовательностей. Длинна повторов CRISPR и спейсеров варьируется от 23 до 47 пар и 21 и 72 пар соответственно. Непосредственно перед последовательностями, разделёнными спейсерами, выделяют лидерную последовательность, содержащую промотер.
В непосредственной близости от локусов CRISPR часто находиться гены Cas (CRISPR-ассоциированные). Набор генов Cas определяет тип CRISPR/Cas системы.
Гены Cas кодируют крупное гетерогенное семейство белков, несущих функциональные домены типичные для нуклеаз, геликаз, полимераз и полинуклеотидсвязывающие белки. Совместно CRISPR и Cas формируют CRISPR/Cas систему [3].
Принцип действия CRISPR/Cas системы
Механизм, использующий последовательности CRISPR, в целях защиты против чужеродного воздействия, на настоящий момент изучен не до конца. Однако, на основании наблюдений взаимосвязи локусов CRISPR и активности белков Cas, а так же, близком расположении последовательностей Cas к локусам CRISPR, было высказано предположение о совместном участии данных последовательностей в реализации адаптивной иммунной функции.
Был описан механизм действия CRISPR/Cas системы. Он включает в себя 5 этапов.
На первом этапе происходит транскрипция участка локуса CRISPR и образуется пре-crРНК.
На втором этапе собирается эффекторный мультибелковоый комплекс Cascade, в структуру которого включается пре-crРНК. Cascade отрезают часть пре-crРНК. При этом, комплекс остаётся связанным с crРНК.
На третьем этапе происходит связывание Cascade с Двухцепочечной ДНК (ДцДНК) — мишенью. Связь образуется за счёт комплементарного спаривания оснований, входящих в структуру Cascade и оснований мишени. После чего к комплексу подходит белок Cas3 и связывается с ДцДНК.
На четвёртом этапе Белок Cas3 производит одноцепочечный разрыв последовательности мишени, отсоединяется от мультибелкового комплекса и движется вдоль ДцДНК, внося в её структуру изменения и разрывы, тем самым препятствуя транскрипции чужеродного генетического материала.
Также были установлены механизмы внесения чужеродных последовательностей в структуру CRISPR в качестве спейсеров. В нём так же принимают участие белки Cas.
Достоверно известно о существовании механизмов предотвращающих аутоагрессию системы CRISPR/Cas в отношении ядерной ДНК клетки-носителя. Интактность собственного генома бактерии обеспечивается специфическими метками, которые представляют из себя последовательности, встречающиеся в геноме бактерии с определённой периодичностью. Данные последовательности предотвращают использование частей генома клетки в качестве спейсеров, а значит и использования их для таргетного воздействия белков Cas. Так же для некоторых типов CRISPR/Cas систем обязательным для действия эффекторного мультибелкового комплекса Cascade необходимо, содержания мотива PAM на мишени [4].
Активность CRISPR/Cas в отношении МГЭ
CRISPR/Cas имеет эволюционный недостаток. Так как, часть спейсеров несут последовательности характерные для плазмид. Соответственно CRISPR/Cas способна препятствовать приобретению полезных и необходимых для адаптации и даже выживания бактерии-носителя качеств. Что может быть использовано в решении проблемы антибиотикорезистентности, так как, искусственно изменяя активность данной системы возможно влиять на приспособленность бактерий. [4]
Исследования лаборатории бактериологии университета «Рокфеллера», показали, как бактерии справляются с данным недостатком. В их исследовании они, использовали математические модели и эксперименты с Staphylococcus epidermidis и стафилококковой конъюгативной плазмидой pG0400. [5]
По результатам исследования были обнаружены механизмы, посредством которых популяции бактерий могут приобретать необходимые плазмиды без потери иммунитета CRISPR/Cas. Однако, одним из наиболее вероятных механизмов является дезактивация и удаление области CRISPR/Cas. Эти результаты дают объяснение значительных изменений в существовании, числе и функции CRISPR/Cas внутри и между видами микробов.
Соответственно, было предположено, что локусы CRISPR-Cas находятся в непрерывном состоянии потока: приобретаются путем горизонтального переноса гена, повышают активность и количественно увеличиваются, когда популяции сталкиваются с фагом. И быстро теряются, когда инфекционно передаваемые гены и генетические элементы необходимы для адаптации и выживания популяции бактерий.
Механизмы изменения активности CRISPR/Cas Слабо изучены. На данный момент достоверно известно о зависимости между стрессовым воздействием различной природы на клетку и активностью системы CRISPR/Cas. Так у Salmonella enterica serovar Typhi в ответ на избыток питательных веществ синтезируется белковый репрессор, снижающий активность CRISPR/Cas. У некоторых видов активация CRISPR/Cas происходит при осмотическом стрессе.
Предполагают, что стрессовые факторы и проникновение МГЭ сходно действют, что и повышает активность CRISPR/Cas системы [5].
Заключение
CRISPR/Cas система, как перспективный инструмент в генной инженерии, на данный момент, получила широкое освещение в научной литературе. Её возможное применение в практической медицине же, освещено куда меньше.
Использование механизмов CRISPR/Cas потенциально может помочь в решении проблемы антибиотикорезистентности клинически значимых штаммов, а также открыть новое направление в терапии бактериальных заболеваний. Так же, фундаментальные принципы функционирования данной системы требуют более глубокого изучения.
Литература:
- Михеева Л. Е., Карбышева Е. А., Шестаков С. В. Роль мобильных генетических элементов в эволюции цианобактерий // Экологическая генетика. — 2011. — № 4. — С. 52–62.
- Parmit Kumar Singh, Guillaume Bourque, Nancy L Craig. Mobile genetic elements and genome evolution // Mobile DNA. — 2014. — № 26. — С. 26–36.
- Jennifer A. Doudnam, Emmanuelle Charpentier. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 // Science. — 2014. — № 346. — С. 1258096–1–1258096–9.
- Edze R. Westra, Angus Buckling, Peter C. Fineran. CRISPR–Cas systems: beyond adaptive immunity // Nature Reviews Microbiology. — 2014. — № 12. — С. 317–326.
- Wenyan Jiang, Inbal Maniv, Fawaz Arain. Dealing with the Evolutionary Downside of CRISPR Immunity: Bacteria and Beneficial Plasmids // PLoS genetics. — 2013. — № 9. — С. 1–13.
