В статье авторы рассказывают о современном методе редактирования генов CRISPR/Cas9.
Ключевые слова: CRISPR, клетка, система, ген, стволовая клетка человека, ДНК.
Человеческое тело — довольно сложный механизм, который до сих пор изучен не до конца. В нашем организме существует более тридцати триллионов клеток, которые организуются вместе в ткани и выполняют определенные функции, они нужны для нормальной физиологии человека. Они поддерживают правильное протекание физиологических процессов и биохимических реакций. В клетках содержится ДНК, которая выполняет функцию хранения и передачи из поколения в поколение генетической программы функционирования организма. ДНК записывает на себе информацию о белках нашего тела с помощью нуклеотидов (генетического кода). Ежедневно в клетках человека, а именно в структуре ДНК, происходят повреждения. Они могут быть связаны с тем, что при естественном метаболизме образуются определённые химические соединения, такие как активные формы кислорода (ионы, свободные радикалы и перекиси), токсичные формы азота, алкилирующие агенты и т. д. Также последовательность ДНК может повреждаться из-за ионизирующего излучения и химических мутагенов. Клетка, в таких случаях, запускает процесс репарации ДНК, а именно, восстановления ДНК после химических повреждений или разрывов. В защите ДНК и всей клетки так же участвует система CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) и связанные с ней белки Cas. Они образуют целую систему защиты наследственной информации хозяина от чужеродной ДНК бактериофага. Впервые локус CRISPR был обнаружен в 1987 году у бактерии Escherichia Coli группой ученых во главе Ёсидзуми Исино. Тогда они заметили повторяющиеся элементы в ДНК, которые были разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Но в то время — это открытие не имело никакого значения, никто не понимал зачем же нужны эти повторяющиеся элементы. В 1993 г. исследователь Франсиско Мохика обнаружил такие же повторяющиеся последовательности в геноме археи и связал их с геномом E. coli. Далее он продолжил изучать этот вопрос и нашёл такие же палиндромные участки у 20 микроорганизмов. В 2002 г. Мохика вместе с коллегами опубликовали результаты исследований, в которых было сказано, что локусы CRISPR связаны с адаптивным иммунитетом прокариот. Такие выводы группа ученых сделала на основе того, что штаммы E. coli, чьи повторяющиеся участки содержат спейсер, соответствующий определенному фагу, являются устойчивыми к этому фагу. Позже, начались серьезные исследования систем CRISPR, были описаны виды этих систем и предложен механизм работы. Система CRISPR/Cas9 работает определенным образом.
Нуклеаза разрывает в сайтах-мишенях обе цепи ДНК, репарация которых впоследствии происходит по одному из следующих механизмов:
Соединение концов негомологичным образом, при условии которого возникают ошибки, приводит в результате к формированию в целевом локусе мутаций по типу делеций и инсерций.
Гомологичная рекомбинация, при которой гомолог, не подверженный повреждениям, служит матрицей для регенерации первоначальной структуры молекулы ДНК; подобное действие происходит весьма редко, однако использование CRISPR/Cas9 даёт возможность повысить вероятность проведения гомологичной рекомбинации в несколько раз.
Если добавить к компонентам CRISPR/Cas9 артифициально синтезированную молекулу ДНК, для которой свойственна гомологичность с нуклеотидной последовательностью в месте разрыва, она послужит матрицей для иного репаративного способа — HDR (homology-directed repair), который заключается во встраивании относительно небольшого фрагмента артифициальной матрицы в целевой локус. В качестве подобной матрицы в основном используют два типа структур: одноцепочечные олигонуклеотиды или плазмидные векторы.
В первом случае проводится искусственный синтез олигонуклеотидов, гомологичных сайту, в котором формируется двухцепочечный разрыв, оптимальная длина которого в среднем составляет около 90 нуклеотидов. Данные олигонуклеотиды могут в немногом отличаться от целевого сайта.
При условии использования плазмидных векторов в роли донорных молекул для рекомбинации в них клонируют относительно длинные плечи гомологичных участков (от пятисот до нескольких тысяч пар нуклеотидов). Подобные плечи гомологии способны фланкировать дополнительные элементы, например, гены-репортёры, гены устойчивости к антибиотикам и другие. Благодаря HDR в целевой локус возможно помещение сайта рестрикции, маркерной метки или же нуклеотидов, исправляющих «неправильные» ДНК. Однако HDR активно происходит только в делящихся клетках; ее эффективность зависима от типа клетки, стадии жизнедеятельности и целевого локуса генома и матрицы.
Таким образом, с помощью сайт-специфических эндонуклеаз могут быть получены мутации:
– Негомологичное соединение концов при условии отсутствия донорной плазмиды опосредует делеции или инсерции малого количества нуклеотидов сайта-мишени и, в качестве одного из результатов, произойдёт генный нокаут вследствие мутаций рамки считывания и образования стоп-кодонов;
– В случае присутствия двухцепочечных олигонуклеотидов или донорной плазмиды фрагменты ДНК длиной свыше 14 т.п.н. встраиаваются способом лигирования, сопровождающегося негомологичным сшиванием концов;
– Параллельное внесение определённого количества двухцепочечных разрывов приводит к делециям, инверсиям или транслокациям участков ДНК, расположенных между этими разрывами;
– Гомологичная рекомбинация при условии присутствия донорной плазмиды с гомологичными плечами, фланкирующими встраиваемый фрагмент, линейной донорной последовательности с гомологией не более, чем 50 т.п.н. или олигонуклеотида приводит к введению одного или нескольких трансгенов для исправления или замены имеющихся генов.
На данный момент описанные выше методы активно используются в фундаментальных или же прикладных исследованиях. Редактирование генома возможно как in vitro при доставке элементов системы CRISPR/Cas в культуры выращенных клеток, так и in vivo посредством инъецирования мРНК в зиготы.
Редактирование генома in vitro
Линии клеток НЕК293T/НЕК293FT, легко подвергаемые трансформированию плазмидами и достаточно простые в поддержании, наиболее часто применяются с целью проверки эффективности работы системы CRISPR/Cas в человеческой модели in vitro. По данным исследований разных авторов, уровень целевых мутаций, а также гомологичной рекомбинации с донорными плазмидами/олигонуклеотидами варьирует в широких пределах. Этот факт, скорее всего, обусловлен не только методом, но и линиями клеток и непосредственно сайтом-мишенью. Культивируемые линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и эмбриональных стволовых клеток человека являются особо интересным объектом изучения регенеративной медицины, исследования структуры и закономерностей работы сложных сетей генов, создания систем для поиска медикаментов и множества прочих фундаментальных биомедицинских исследований.
Посредством использования технологии, основанной на CRISPR/ Cas9, были созданы изогенные стволовые клетки человека, ведётся разработка методов коррекции мутантного фенотипа клеток, осуществляются работы по вопросу регуляции экспрессии генов, исследованию функциональных взаимоотношений между группами генов различной величины и визуализации функционирующих участков генома живых клеток.
Создание линий изогенных плюрипотентных стволовых клеток человека способствует осуществлению моделирования наследственных и многофакторных заболеваний, скринингу обширных библиотек лекарственных средств, а также поиску новых типов мутаций, участвующих в определённом патологическом процессе. На сегодняшний день активно проводятся работы по всем этим направлениям. Систему CRISPR/Cas9 эффективно использовали в целях создания модели синдрома ICF (immunodeficiency, centromeric region instability and facial anomalies syndrome; иммунодефицит, нестабильность центромерных районов хромосом и лицевые аномалии) на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека. Было произведено получение гомозиготных мутаций в гене DNMT3B с приблизительной частотой 63 %, причём для клеток был характерен фенотип центромерной нестабильности. Особую актуальность обретает изучение тяжелых нейродегенеративных заболеваний, самыми значительными из которых являются болезни Альцгеймера, Паркинсона, различной этиологии мышечные атрофии.
По причине того, что Cas9 распознаёт конкретную мишень в геноме при условии участия короткой последовательности направления в sgRNA, в современных условиях достаточно просто собрать достаточно большую библиотеку олигонуклеотидов и соответственно sgRN A, которая будет охватывать масштабы целого генома. Использование в качестве вектора, доставляющего компоненты CRISPR/Cas9, лентивирусов, стабильно поддерживающихся в геноме и реплицирующихся совместно с геномной ДНК, поспособствовало разработке новой технологии GeCKO — CRISPR-Cas9-нокаут в рамках генома (Genome-scale CRISPR/Cas9 knockout). Большая библиотека sgRNA делает возможным выключить транскрипцию большинства генов одновременно и сформировать тем самым функциональные взаимоотношения между этими генами, роль в определённых процессах жизнедеятельности или вовлеченность в процесс патогенеза. С помощью использования лентивирусной библиотеки, охватывающей 18080 генов (3–4 sgRNA на каждый ген), выявились гены, необходимые для жизнедеятельности канцерных клеток (А375 — клеточная линия меланомы человека) и плюрипотентных стволовых клеток (линия HUES62). Оказалось, что в формирование резистентности к вемурафенибу (PLX), являющемуся BRAF-ингибитором протеинкиназ при меланоме, вовлечены не только гены NF1 и MED12, но и ген CUL3, а также обширный комплекс гистон-специфических ацетилтрансфераз STAGA: TADA1 и TADA2. С помощью применения лентивирусной библиотеки, содержащей порядка 73000 sgRNA, по шаблону линий опухолевых клеток KBM7 и HL60 были изучены гены, задействованные в пролиферации и клеточном цикле. Доказано, что мутации, которые приводят к формированию нефункциональных продуктов 4 репаративных генов однонуклеотидных замен в ДНК (MMR) — MSH2, MSH6, MLH1, PMS2, способствуют формировании устойчивости к нуклеотидному аналогу 6-тиогуанину и, следовательно, индуцируют пролиферацию клеток. Были также исследованы закономерности функционирования генов TOP2A, CDK6, BCR, ABL1 и генов, кодирующих рибосомальные белки.
Таким образом, применение библиотек CRISPR/Cas9 делает возможным осуществление функционального скрининга геномов, который, в свою очередь, может дать важные сведения о физиологических и биохимических процессах клеток разного типа, способствуя раскрытию молекулярных механизмов патогенеза и выявлению потенциальных мишеней для медикаментозной и генной терапии.
Методы, базирующиеся на применении системы CRISPR/Cas9, могут быть эффективно использованы для редактирования геномов культур стволовых клеток. К примеру, применение систем редактирования геномов способствует исправлению точковых мутаций в клетках, полученных от организма больного. В роли объекта исследования в данном случае выступают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и региональные стволовые клетки. В свою очередь, донорными молекулами могут быть как сложные генетические конструкции, так и одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК.
Занимательным примером такого подхода является работа, в которой произведена коррекция локуса CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductor regulator, муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости) в культивируемых интестинальных стволовых клетках, полученных от больных муковисцидозом (CF — cystic fibrosis, муковисцидоз). Данный подход способствует получению так называемые органоидов — функциональных многоклеточных образований с редактированным геномом, аутологичных относительно донора клеток, которые повторно могут быть внедрены в организм больного. Бесспорно, это направление имеет невероятно большие перспективы для клеточной терапии заболеваний человека.
В контексте функциональной коррекции генетических аномалий, обусловленных делецией генов или нарушениями экспрессии, выраженных в значительном снижении уровня продуктов геноа, возможно использование контролируемого внедрения трансгенов в геном. Существуют определённые участки генома, внесение трансгенов в которые является безопасным. В их число входят сайты наподобие AAVS1, обеспечивающие стабильную экспрессию внедрённого трансгена. Таким образом, система CRISPR/Cas эффективно применяется в функциональной геномике клеток, в частности, с целью создания клеточных моделей заболеваний человека и клеточной терапии.
Область применения системы CRISPR-Cas9 и ее модификационных вариантов очень широка. Ее условно подразделяют на три большие группы: для исследований, для биотехнологий и для терапии.
CRISPR-Cas9 в исследовательской области дает возможность определять значение конкретного гена при росте, развитии и в процессах жизнедеятельности данного организма, позволяет выявить роль определенного гена в появлении, развитии и прогрессировании генетически заложенных заболеваний и раковых опухолей, посредством создания модельных систем. В Cas9 имеется два нуклеазных домена: если убрать один из них (белок становится никазой nCas9), то белок сможет разрезать только одну цепь ДНК, а если убрать два (получим «мертвый» d Cas9), то ни одной цепи ДНК белок разрезать не сможет. В последнем случае применение данного белка позволяет репрессировать не один отдельный ген, а их набор. Кроме того, Cas9 можно использовать для создания платформы, на базе которой становится возможным конструирование более сложных комплексов, направленных на регуляцию и модификацию организма.
CRISPR-Cas9 в области биотехнологий служит для трех основных целей. Первая — изменение свойств животных и растений, важных для сельского хозяйства. Благодаря системе улучшаются вкусовые качества и показатели пищевой ценности, появляется устойчивость к условиям окружающей среды и вредителям растений. У животных систему применяют для репрессии нежелательных генов. Вторая цель — осуществление контроля над распространяемыми животными инфекциями, например, малярийного плазмодия. Третья цель — получение новых или улучшенных ферментных систем бактерий или грибов, применяемых в промышленности. Система позволяет не только создавать такие системы, но и защищать их от мутаций.
CRISPR-Cas9 в терапии нашли колоссально широкое применение. На данный момент систему успешно применяют при лечении опухолей (белок уничтожает все виды РНК в данной клетке или группе клеток тем самым препятствует биосинтезу белка и ферментов, что приводит к неминуемой гибели клетки); хронических заболеваний вирусной природы, в том числе ВИЧ и гепатита (система вырезает участок вирусной ДНК из ДНК клетки хозяина). Система позволяет бороться с моногенными наследственными заболеваниями, в том числе серповидноклеточной анемией, муковисцидозом, синдромом миодисторфии Дюшенна, катаракты, гемофилии и лейкемии. Помимо этого на данном этапе используют редактирование генома не только зародыша и стволовых клеток, но и соматических клеток взрослого, уже сформированного организма.
Преимуществ применения системы CRISPR-Cas9 при лечении людей множество. Например, использование данной системы при лейкемии подразумевает получение образца костного мозга пациента. Система изменяет геном собственных кроветворных клеток человека. После этого больного необходимо облучить, чтобы дефектные кроветворные летки погибли, и на место погибших ввести модифицированные клетки обратно. И основным «плюсом» именно такого лечения является то, что подсаживаемые клетки принадлежат самому пациенту, а не донору, а значит будет полная совместимость и приживляемость. Данные клетки начнут делится и производить здоровые клетки крови. Однако, если говорить о редактировании, например, гепатоцитов, то возникает проблема доставки компонентов CRISPR-Cas9 к пораженному органу. к сожалению, это не единственная проблема. В 2015 году китайские ученые применили систему CRISPR-Cas9 на человеческом эмбрионе. Целью был ген, вызывающий болезнь бета-талассемию. В исследуемую клетку вводили белок Cas-9 и РНК-гид. В 5–10 % случаев дефектный ген был исправлен. Но во всех клетках исследуемых эмбрионов обнаружилось большое количество мутаций в тех местах, где это не предполагалось. Это доказывает, что проблему неправильного узнавания интересующего участка избежать очень трудно. Решение этой проблемы очевидно — необходимо улучшать специфичность белка Cas-9 и тщательно выбирать гиды.
За время существования системы CRISPR/Cas9, она хорошо зарекомендовала себя в опытах над животными, такими как мыши и рыбки Данио. Поэтому научная сфера решилась использовать технологию на людях.
Так, в апреле 2015 г. группа ученых из Китая под руководством генетика Цзюньцзю Хуана провела попытку редактирования генома эмбриона человека. Задачей было изменение гена, который отвечает за развитие бета-талассемии. В результате мутации в одном из аллей гена HBB (ген бета-глобина) нарушается синтез бета-цепи гемоглобина А и его количество в крови падает. Ученые использовали нежизнеспособные эмбрионы, которые проходят только первые стадии развития.
Ход работы был следующим: Цзюньцзю Хуан и его коллеги индуцировали ферментную конструкцию CRISPR/Cas9 в 86 эмбрионов. По прошествии двух дней CRISPR/Cas9 должна исправить мутировавший ген, а эмбрионы достичь восьмиклеточной стадии. Таким образом из 86 эмбрионов выжили 71, из них только у 28 цепочка ДНК срастилась после разрыва, и лишь у некоторых этих эмбрионов дефектный ген был заменен на нормальный. Вдобавок наблюдались геномы эмбрионов с побочными мутациями.
Уже в 2016 г. в лаборатории Oregon Health and Science University г. Портланд, США, группа американских исследователей вместе с коллегами из Южной Кореи, под руководством американского биолога Шухрата Миталипова, отредактировали геном человеческого эмбриона на ранней стадии развития. До этого попытки редактирования проводились в Китае, но в них имелись несколько неточностей:
- Первое, наблюдался мозаицизм, то есть необходимое изменение было не у всех эмбрионов.
- Второе, при использовании системы CRISPR/Cas9 обнаруживались побочные (нецелевые) мутации.
В данном исследовании использовалось несколько десятков эмбрионов, из ДНК которых удалили мутировавший ген MYBPC3, провоцирующий одну из разновидностей кардиомиопатии. При этом применённые эмбрионы не предполагали пересадить в матку для дальнейшего их развития и в последующем рождении, поэтому они были уничтожены на ранних стадиях развития. В итоге, в 72 % случаев результат оказался успешным, потому что мутировавший ген был удален, а мозаицизм и побочные мутации не наблюдались.
Начало ноября 2018 г. Университет науки и технологии в Шэньчжэне проводит набор пар, в которых отец должен быть ВИЧ-положительным. Эти пары будут участвовать в эксперименте, руководил которым молекулярный биолог Хэ Цзянькуй. Ученый хотел внести изменения в ДНК зародыша, тем самым сделав его невосприимчивым к ВИЧ.
В научной среде давно известно про мутацию CCR5-дельта32, в результате которой происходит нарушение функции белка CCR5. Дело в том что данный белок – рецептор, обладающий адгезивными свойствами и располагающийся на Т-лимфоцитах, а Вирус Иммунодефицита Человека использует эти рецепторы для проникновения в лимфоциты. Хэ Цзянькуй решил вызвать эту мутацию искусственно.
У эмбрионов в возрасте до двадцати четырех недель, используя систему CRISPR/Cas9, удалили 32 пары нуклеотидных оснований гена CCR5. Благодаря этому ВИЧ не сможет взаимодействовать с рецепторами. Следующим шагом было внедрение модифицированных эмбрионов в матку.
В положенный срок родилиcь две девочки Лулу и Нана, однако получить желаемой мутации не удалось. У одной, в одной копии гена удалилось 15 нуклеотидных пар, в другой копии—ничего не изменилось, у второй девочки в одной копии удалено 4 нуклеотидных пар, в другой наблюдалась вставка пары нуклеотидов. Вдобавок ко всему не удалось избежать мозаицизма.
Пусть некоторые из экспериментов и были удачными, они все равно подвергались общественной критике. Именно поэтому Хэ Цзянькуй был осужден и в 2019 г. получил три года лишения свободы. Так как из соображений этических норм человек не может быть использован в качестве подопытного.
Литература:
- Власов В. В., Медведев С. П., Закиян С. М. «Редакторы» геномов. От цинковых пальцев до CRISPR // Наука из первых рук. — 2014. — № 2 (56). — С. 44–53.
- Немудрый А. А., Валетдинова К. Р., Медведев С. П., Закиян С. М. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas — инструменты открытий // Acta Naturae. — 2014. — № 3 (22). — С. 20–42.
- Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S. D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin // Microbiology. — 2005. — Vol. 151.
