Цитопротекторный потенциал экстрактов клюквы, брусники, черники



В статье изучены цитопротекторные эффекты полифенольных экстрактов клюквы, черники, брусники на клеточных культурах in vitro. Установлен полифенольный состав экстрактов клюквы, черники, брусники из северо-западного региона Западной Сибири, наибольшую концентрацию полифенольных компонентов определили для экстракта черники. Для всех экстрактов северных ягод выявлен в экспериментах in vitro цитопротекторный потенциал, зависимый от концентрации полифенолов.

Ключевые слова: полифенол, антиоксидант, цитопротектор.

Биологически активные продукты из ягод могут иметь терапевтическое значение и использоваться не только в комплементарной или альтернативной медицине, но и в медицине традиционной. Среди ягод, которые наиболее интенсивно исследуются, темно-окрашенные северные ягоды, а именно клюква, черника, брусника, занимают особое место, поскольку перспективы получения эффективных лекарственных препаратов или биологически активных пищевых добавок из них наиболее очевидны, судя по наличию большого количества доказательного материала в экспериментах и клинике [1].

Терапевтический потенциал северных ягод, а именно, клюквы, черники, брусники, связывают с уникально высоким содержанием полифенольных субстанций [2]. Известно, что полифенолы синтезируются растениями как вторичные метаболиты и предназначены, как защитные механизмы против стрессоров, включая различные патогены [3].

На основании анализа экспериментальных данных, описанных в доступной литературе, указывающих на вероятность высокого антиоксидативного и цитопротекторного потенциала для северных ягод и на возможность изменения течения ряда патофизиологических процессов на моделях возраст-ассоциированной патологии, была сформулирована следующая рабочая гипотеза. Полифенольные экстракты северных ягод (клюквы, брусники, черники) вследствие высокого содержания в своем составе полифенолов, способны обладать антиоксидантными и цитопротекторными свойствами, ограничивать проявления оксидативного стресса.

Целью исследования явилось изучение цитопротекторных эффектов полифенольных экстрактов клюквы, черники, брусники на клеточных культурах in vitro.

Материалы иметоды исследования

Водно-спиртовые экстракты были получены из ягод клюквы, черники, брусники, собранных в летне-осенний период 2015 года в Сургутском районе Ханты-Мансийского округа Тюменской области Российской Федерации. Для исследования были взяты как первичные экстракты ягод, так и их стандартизованные по фенольному числу версии. Водно-спиртовой экстракт концентрировали выпариванием в вакууме (7 g) в роторном испарителе с целью устранения спирта. Стандартизацию проводили по общему фенольному числу — 10 мг/мл.

Концентрацию полифенолов в образцах исследовали, используя коммерческий набор для определения концентрации полифенолов «Polyphenols folin-ciocalteu (ENOLOGY line by BioSytems. Spain)». Концентрации выражены в мг/л эквивалента галловой кислоты (gallic acid) на основе стандартной кривой, созданной по галловой кислоте. Общее количество мономерных антоцианов (anthocyanin, ANC) измеряли с помощью спектрофотометрического метода [4].

Анализ содержания фенольных соединений проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа Agilent 1290 Infinity. Идентификация фенольных соединений проводилась в соответствии с временами удерживания и спектрами поглощения соответствующих аналитических стандартов [5–7]. Количественная характеристика содержания индивидуальных соединений проводилась с использованием калибровочных кривых по соответствующим стандартным образцам.

Потенциальную цитотоксичность и вероятные цитопротекторные свойства экстрактов северных ягод оценивали в МТТ-тесте на первичной культуре альвеолярных макрофагов кролика и перевиваемой клеточной культуре НЕК293 (human embryonic kidney, АТСС® CRL-1573™) — клетки почки эмбриона человека.

После подсчёта клеток альвеолярных макрофагов кролика суспензию разводили культуральной средой таким образом, чтобы в конечном разведении число клеток в суспензии оказалось 1х10⁶/мл, после чего клеточную суспензию переносили в 24-луночные планшеты для культивирования по 1,0 мл в каждую лунку и инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут. После прикрепления макрофагов ко дну планшета исходную среду меняли на свежую тёплую среду (37°С), удаляя из культуры не прикрепившиеся посторонние клетки. В лунки вносили исследуемые соединения (0,1 мл): экстракты клюквы, черники и брусники в разведениях 1:10 и 1:100; доксорубицин в конечной концентрации 1 мкг/мл и 10 мкг/мл; доксорубицин 10 мкг/мл + экстракты клюквы, брусники, черники (разведение 1:100); контроль — клетки без добавления исследуемых субстанций (0,1 питательной среды). Инкубировали при 37°C в атмосфере CO₂ (5 %) в течение 2 часов. Жизнеспособность клеток в контроле (клетки без добавления экстрактов) принимали за 100 %. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трёх повторностях. Число экспериментов — 5 (взято было 5 кроликов).

Клетки НЕК293 выращивали в среде DMEM с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2мM L-глутамина, 1 % гентамицина при 37°C в атмосфере CO₂ (5 %). Через 48 часов клетки сеяли в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл клеточной суспензии на лунку (10⁴ клеток в каждой лунке), помещали в СО₂-инкубатор. К культуре клеток были добавлены тестируемые соединения (экстракты клюквы, черники и брусники в разведениях 1:10 и 1:100; доксорубицин в конечной концентрации 1 мкг/мл и 10 мкг/мл; доксорубицин 10 мкг/мл + экстракты клюквы, брусники, черники (разведение 1:100); контроль — клетки без добавления исследуемых субстанций), и далее клетки культивировали в тех же условиях 48 часов. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трёх повторностях. Число экспериментов — 5 (в разное время использовано 5 образцов клеточной культуры).

Результаты исследований иих обсуждение

Концентрация полифенолов в экстракте брусники составила 8723 ± 304 мг/л, в экстракте клюквы — 4930 ± 152 мг/л, в экстракте черники — 17610 ± 811 мг/л. Полученные данные свидетельствуют, что наибольшая концентрация полифенолов присутствует в экстракте черники, несколько ниже в экстракте брусники и существенно меньше в экстракте клюквы.

Более детально состав полифенольных компонентов водно-спиртовых экстрактов черники, брусники и клюквы представлен в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Состав фенольных соединений вэкстрактах северных ягод (черники, брусники, клюквы), мг/л

№	Фенольное соединение	Клюква	Брусника	Черника
1	Gallic acid	N	N	173
2	Protocatechuic acid	10	26	118
3	Tyrosol	6,4	N	N
4	4-Hydroxybenzoic acid	N	~39	N
5	Procyanidin B 1	26	~195	49
6	3-p-Coumaroylquinic acid*	30	N	130
7	(+)-Catechin	113	438	42
8	Chlorogenic acid (5-Caffeoylguinic acid)	533	240	342
9	Procyanidin	179	243	16
10	trans-Caffeic acid	4,3	13	4,7
11	Syringic acid	N	N	10
12	Procyanidin B 2	13	233	42
13	(−)-Epicatechin	20	222	~700
14	trans-p-Coumaric acid	3,7	119	10
15	Myricetin-glycoside	168	N	33
16	trans-Ferulic acid	3,9	24	N
17	Procyanidin	152	327	N
18	Quercetin-3-glucuronide	N	N	130
19	Quercetin-3-galactoside	186	36	606
20	Quercetin 3-glucoside	15	6,2	156
21	Procyanidin	N	178	N
22	Quercetin 3-xyloside	24	7,9	N
23	Quercetin 3-arabinopyranoside	55	16	N
24	Quercetin 3-arabinofuranoside	32	20	N
25	Kaempferol 3-glucoside	N	N	6,6
26	Quercetin-3-rhamnoside (quercitrin)	25	83	7,4
27	Myricetin	9,2	N	43
28	Procyanidin	32	203	N
29	Quercetin	9,4	25	26
30	Kaempferol	N	0,7	N
31	Hydroxybenzoic acids	17	65	301
32	Hydroxycinnamic acids	575	397	487
33	Flavonols	524	195	1007
34	Flavan-3-ols	535	2039	890
	Всего:	1651	2696	2685

Примечание: N — нет данных

Таблица 2

Состав антоцианов вэкстрактах северных ягод (черники, брусники, клюквы), мг/л

№	Антоциан	Клюква	Брусника	Черника
1	Delphinidin-3-O-galactoside	6,3	N	1268
2	Delphinidin-3-O-glucosidest	3,8	N	1985
3	Cyanidin-3-O-galactoside	115	818	945
4	Delphinidin-3-O-arabinoside	N	N	1043
5	Cyanidin-3-O-glucoside	9,2	64	1495
6	Petunidin 3-O-galactoside	N	N	379
7	Cyanidin-3-O-arabinoside	111	109	817
8	Petunidin-3-O-glucosidest	2,0	N	971
9	Peonidin-3-O-galactoside	135	N	129
10	Petunidin-3-O-arabinoside	N	1,3	239
11	Peonidin-3-O-glucosidest	23	4,0	777
12	Malvidin-3-O-galactoside	N	1,5	263
13	Peonidin-3-O-arabinoside	70	1,7	98
14	Malvidin-3-O-glucosidest	3,5	7,0	1173
15	Malvidin-3-O-arabinoside	10	3,0	259
	Всего	489	1026	11842

Примечания: N — нет данных; ^st — идентификация не подтверждена аналитическим стандартом

В экстрактах клюквы преобладает хлорогеновая кислота, а также изомеры кверцетина, флавонолы и флаваны. Среди антоцианов клюквы в наибольшей концентрации найдены Peonidin и Cyanidin галактазидазы и арабинозидазы. В экстракте брусники наибольшее значение имеет катехин, процианидины и флаваны, а из антоцианов — Cyanidin-3-O-galactoside. В экстракте черники найдены высокие концентрации эпикатехина, кверцетина, флавонолов и флаванов. Содержание компонентов снижается в рядах: по полифенолам — черника — брусника — клюква: проантоцианидинам — брусника — черника — клюква; антоцианинам — черника — брусника — клюква.

Потенциальную цитотоксичность и вероятные цитопротекторные свойства экстрактов северных ягод оценивали по МТТ-тесту. Ниже представлены результаты экспериментов в двух вариантах клеток.

Результаты исследования изменения жизнеспособности изолированных клеток в условиях in vitro под влиянием экстрактов клюквы, черники и брусники в МТТ-тесте на альвеолярных макрофагах кролика представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние экстрактов клюквы, черники ибрусники на жизнеспособность альвеолярных макрофагов кролика (n=5)

Исследуемые субстанции	Относительные значения жизнеспособности, в% от контроля
	Разведение 1:100	Разведение 1:10
Экстракт клюквы	102,0 ± 0,6	127,4 ± 2,4
Экстракт черники	104,5 ± 1,1	156,5 ± 3,8
Экстракт брусники	103,2 ± 1,4	144,4 ± 2,1
Доксорубицин 1 мкг/мл	49,8 ± 6,3
Доксорубицин 10 мкг/мл	17,3 ± 2,8
Доксорубицин 10 мкг/мл + Экстракт клюквы 1:100	62,4 ± 4,4*
Доксорубицин 10 мкг/мл + Экстракт черники 1:100	89,7 ± 6,1*
Доксорубицин 10 мкг/мл + Экстракт брусники 1:100	70,5 ± 5,2*

Примечание: * — р < 0,05 по отношению к значению жизнеспособности в присутствии доксорубицина 10 мкг/мл

В таблице 3 представлены показатели жизнеспособности клеток в % относительно взятой за 100 % жизнеспособности альвеолярных макрофагов кролика в контроле (клетки без добавления экстрактов). Как видно, при добавлении к альвеолярным макрофагам экстрактов северных ягод в разведении 1:100 жизнеспособность клеток в сравнении с контролем не менялась, цитотоксическое действие отсутствовало, при внесении более концентрированного образца экстракта жизнеспособность клеток несколько увеличивалась. Отрицательный контроль, в качестве такового использовали доксорубицин, продемонстрировал очевидное дозозависимое снижение жизнеспособности клеток. Однако, присутствие в питательной среде экстрактов северных ягод нивелирует цитотоксическое действие доксорубицина.

Принципиально сходные результаты мы получили в условиях нашего эксперимента и при инкубации перевиваемой клеточной культуры эпителиальных клеток НЕК293 с экстрактами северных ягод (таблица 4).

Таблица 4

Влияние экстрактов клюквы, черники ибрусники на жизнеспособность клеток НЕК293 (n=5)

Исследуемые субстанции	Относительные значения жизнеспособности, в% от контроля
	Разведение 1:100	Разведение 1:10
Экстракт клюквы	96,1 ± 2,8	142,4 ± 6,3
Экстракт черники	107,6 ± 7,0	188,6 ± 9,4
Экстракт брусники	90,7 ± 8,1	163,7 ± 11,3
Доксорубицин 1 мкг/мл	30,2 ± 4,7
Доксорубицин 10 мкг/мл	13,2 ± 0,9
Доксорубицин 10 мкг/мл + Экстракт клюквы 1:100	103,5 ± 5,3*
Доксорубицин 10 мкг/мл + Экстракт черники 1:100	97,4 ± 5,6*
Доксорубицин 10 мкг/мл + Экстракт брусники 1:100	65,3 ± 3,2*

Примечание: * — р < 0,05 по отношению к значению жизнеспособности в присутствии доксорубицина 10 мкг/мл

Как следует из полученных данных, при инкубации эпителиальных клеток перевиваемой клеточной культуры экстракты северных ягод в разведениях 1:100 не проявляют цитотоксического действия, а способствуют сохранению жизнеспособности клеток, при увеличении концентрации экстрактов ягод показатели жизнеспособности клеток растут. Способность полифенольных экстрактов ягод предохранять клетки от воздействия цитотоксических эффектов наглядно выявляется в экспериментах с доксорубицином. Доксорубицин, как стандарт цитотоксической субстанции, ингибирует жизнеспособность клеток перевиваемой культуры в значительной степени, но внесение экстрактов северных ягод в среду инкубации принципиально меняет положение — клетки сохраняют жизнеспособность.

В обоих экспериментах, и с первичной культурой клеток, и с перевиваемой культурой клеток, при инкубации в течение 2 часов или 48 часов клеток с экстрактами северных ягод выявлена способность экстрактов предупреждать снижение жизнеспособности клеток в присутствии цитотоксического агента. Считаем, что эти результаты дают нам основания для предположения о наличии цитопротекторного потенциала у полифенольных экстрактов северных ягод.

Предполагаем, что входящие в состав экстрактов клюквы, брусники, черники полифенолы (флавоноиды, антоцианы и проантоцианидины), как антиоксиданты, способны защищать клетки от оксидативного повреждения, присутствующего в механизме цитотоксичности доксорубицина. Известно, что токсикологический профиль антрациклиновых антибиотиков (куда относится и доксорубицин) in vivo в целом повторяет клинический профиль данных препаратов [12], а in vitro в отношении неопухолевых клеток именно стимуляция взрыва свободных радикалов кислорода и азота (оксидативный стресс), является пусковым звеном цитотоксичности [13, 14]. Как свидетельствуют литературные данные, полифенолы ягод клюквы, брусники и черники могут иметь существенный антиоксидативный потенциал, что и было показано в ряде работ [15–17], предшествующих нашему исследованию. Результаты, полученные в условиях нашего эксперимента, отчётливо коррелируют с ними.

Предполагаем, что антирадикальный, антиоксидантный эффект полифенолов, содержащихся в экстрактах клюквы, брусники, черники, вероятно является механизмом цитопротекторного действия. Мы вполне согласны с мнением K. S. Bhullar и H. P. Rupasinghe [17] в отношении того, что природные антиоксиданты — полифенолы ягод, фруктов и ряда других растений, способны проявлять цитопротективное действие. Таким образом, полагаем, что есть основания считать цитопротекторный эффект in vitro, может быть частью механизма действия полифенольных экстрактов северных ягод клюквы, брусники, черники.

Заключение

Таким образом, установлен полифенольный состав экстрактов черники, клюквы, брусники из северо-западного региона Западной Сибири, наибольшую концентрацию полифенольных компонентов определили для экстракта черники. Для всех экстрактов северных ягод выявлен в экспериментах in vitro антиоксидантный и цитопротекторный потенциал, зависимый от концентрации полифенолов.

Литература:

1. Fulton S. L., McKinley M. C., Young I. S., Cardwell C. R., Woodside J. V. The Effect of Increasing Fruit and Vegetable Consumption on Overall Diet: A Systematic Review and Meta-analysis // CritRevFoodSciNutr. — 2016. Vol. 56(5). — P. 802–816.

2. Noad R. L., Rooney C., McCall D., Young I. S., McCance D., McKinley M. C., Woodside J. V., McKeown P. P. Beneficial effect of a polyphenol-rich diet on cardiovascular risk: a randomised control trial // Heart. — 2016. — Vol. 102(17). — P. 1371–1379.

3. Pandey K. B., Rizvi S. I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease // Oxid. Med. Cell. Longev. — 2009. — Vol. 2. — P. 270–278.

4. Lee J., Durst R. W., Wrolstad R. E. Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the pH differential method: Collaborative study // J. AOAC International. — 2005. — Vol. 88. — P. 1269–1278.

5. Grace M. H., Esposito D., Dunlap K. L., Lila M. A. Comparative analysis of phenolic content and profile, antioxidant capacity, and anti-inflammatory bioactivity in wild Alaskan and commercial Vaccinium berries // J Agric Food Chem. — 2014. — Vol. 62(18). — P. 4007–4017.

6. Lätti A. K., Riihinen K. R., Jaakola L. Phenolic compounds in berries and flowers of a natural hybrid between bilberry and lingonberry (Vaccinium × intermedium Ruthe) // Phytochemistry. — 2011. — Vol. 72. — P. 810–815.

7. Zheng W., Wang S. Y. Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in Blueberries, Cranberries, Chokeberries, and Lingonberries // J. Agric. Food Chem. — 2003. — Vol. 51. — P. 502−509.

8. Truong V. D., McFeeters R. F., Thompson R. T., Dean L. L., Shofran B. Phenolic acid content and composition in leaves and roots of common commercial sweetpotato (Ipomoea batatas L.) cultivars in the United States // J. Food Sci. — 2007. — Vol. 72. — P. 343–349.

9. Brand-Williams W., Cuvelier M. E., Berset C. Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity // Lebensm Wiss Technol. — 1995. — Vol. 28. — P. 25–30.

10. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Radical Biol. Med. — 1999. — Vol. 26. — P. 1231–1237.

11. Miller N. J., Rice-Evans C., Davies M. J., Gopinathan V., Milner A. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates // Clin Sci (Lond). — 1993. — Vol. 84. — P. 407–412.

12. Szwed M., Wrona D., Kania K. D., Koceva-Chyla A., Marczak A. Doxorubicin-transferrin conjugate triggers pro-oxidative disorders in solid tumor cells // Toxicol In Vitro. — 2016. — Vol. 31. — P. 60–71.

13. Wei L., Surma M., Gough G., Shi S., Lambert-Cheatham N., Chang J., Shi J. Dis-secting the Mechanisms of Doxorubicin and Oxidative Stress-Induced Cytotoxic-ity: The Involvement of Actin Cytoskeleton and ROCK1 // PLoS One. — 2015. — Vol. 10(7):e0131763.

14. Mai Y., Yu J. J., Bartholdy B., Xu-Monette Z. Y., Knapp E. E., Yuan F., Chen H., Ding B. B., Yao Z., Das B., Zou Y., Young K. H., Parekh S., Ye B. H. An oxidative stress-based mechanism of doxorubicin cytotoxicity suggests new therapeutic strategies in ABC-DLBCL // Blood. — 2016. — Vol. 128(24). — P. 2797–2807.

15. Namiesnik J., Vearasilp K., Nemirovski A., Leontowicz H., Leontowicz M. In vitro studies on the relationship between the antioxidant activities of some berry extracts and their binding properties to serum albumin // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2014. — Vol. 72(6). — P. 2849–2865.

16. McKay D. L., Chen C. Y., Zampariello C. A., Blumberg J. B. Flavonoids and phenolic acids from cranberry juice are bioavailable and bioactive in healthy older adults // Food Chem. — 2015. — Vol. 168. — P. 233–240.

17. Bhullar K. S., Rupasinghe H. P. Antioxidant and cytoprotective properties of partridgeberry polyphenols // Food Chem. — 2015. — Vol. 168. — P. 595–605.