В течение многих лет исследователи появление новых белков просто констатировали путем хроматографии, различными видами электрофореза. Появление новой полосы или фракции характеризовали как новый белок или пептид, хотя в каждой зоне вполне возможно наличие нескольких молекул. Идентификация белков проводилась в отношении только нескольких белков. Появление новых методов позволяет проводить массовую идентификацию большого количества белков. Наши исследования проводились на Mass-Spectrometer (Bruker 6300 series). Полученные при подготовке образцов пептиды были проанализированы с помощью nano-HPLC (AgilentTechnologies 1200), который непосредственно связан с ион-трап масс спектрометром. Сочетание сложного хроматографического оборудования и метода подготовки образца затрудняет массовое использование методов протеиномики. В связи с этим наличие прописей по подготовке образцов и режимы проведения анализов являются важными для развития данного направления. Описанию метода идентификации белков и посвящена данная статья.
Описание прописи подготовки образца
Методика выделения иидентификации белков при замораживании
1) взять чистые контейнеры и шары,
2) разместить изучаемый материал в двух контейнерах,
3) примерно по 1 г изучаемого материала в каждом контейнере. Последующие этапы замораживания проводят в жидком азоте,
4) поместить изучаемый материал в контейнер, положить шар во внутрь, закрутить верхнюю часть контейнера и поставить его на встряхивание (RetschMM 400) на 2 минуты, частота 30 1/S.
5) повторять встряхивание 9 раз, замораживая контейнера с изучаемым материалом перед каждым встряхиванием,
6) с помощью замороженных шпателей собрать порошок со стенок контейнера в пробирку объёмом 50 ml. Пробирки также должны быть охлаждены в жидком азоте,
7) взвесить порошок. Хранить при — 80°С,
8) в полученный порошок добавить загрузочный буфер 1х (loadingbuffer 1х, состав смотри ниже) из расчета 50 mg/ml,
9) перемешиваем смесь на термо-шейкере в течение 10 минут при +95°С,
10) из полученного раствора берётся аликвота и вносится в лунки SDS-PAGE геля.
Состав загрузочного буфера. Чтобы приготовить 3 ml загрузочного буфера1х, нужно:
0, 75 ml LDS 4x
0, 3 ml DTT (1 M)
0, 03 mlBPB (1 %)
1,92 mlH2O
Протоколокрашиваниябелкового SDS-PAGE геля Coomassie
1)Промывка геля
Положить гель в чистую посуду и промыть в течение 3–5 минут с 100–200 ml ультрачистой воды.
2)Окрашивание.
Добавить 20 ml окрашивающей жидкости (ImperialProteinStain) на гель. В зависимости от геля и размера посуды может потребоваться дополнительная добавка красителя. Оставить гель для окраски, на час медленно покачивая на шейкере.
3)Удаление краски с геля.
Слить краску. Положить гель в ультрачистую воду на 1–2 часа. Примечание: частая замена воды снизит время требуемая для появления зон.
Протокол окрашивания белкового SDS-PAGE геля серебром.
1) приготовление растворов:
а) фиксирующий раствор
этанол 40 ml
уксусная кислота 10 ml
ультрачистая вода до 100 ml
б) раствор, повышающий чувствительность
этанол 30 ml
сенситизер 10 ml
ультрачистая вода до 100 ml
в) окрашивающий раствор
краситель 1 ml
ультрачистая вода до 100 ml
г) проявляющий раствор
проявитель 10 ml
усилитель проявителя 1 капля
ультрачистая вода до 100 ml
Примечание: все растворы могут быть приготовлены до начала окрашивания или до перехода в последующие этапы. 100 ml раствора рассчитаны на 1 гель.
2) положить гель в чистую посуду и промыть несколько раз ультрачистой водой,
3) добавить к гелю 100 ml фиксирующего раствора и держать 20 минут при мягком покачивании.
Примечание: гель может храниться в фиксирующем растворе ночь, если недостаточно времени чтобы закончить всё окрашивание,
4) вылить фиксирующий раствор и промывать гель 30 % этанолом в течение 10 минут.
5) вылить этанол и добавить 100 ml раствора, повышающего чувствительность. Инкубировать гель в этом растворе 10 минут.
6) вылить раствор, повышающий чувствительность и промыть гель с 100 ml 30 % этанола 10 минут,
7) вылить этанол и промыть гель с 100 ml ультрачистой воды в течение 10 минут,
8) инкубировать гель в 100 ml окрашивающего раствора на 15 минут,
9) после окраски вылить окрашивающий раствор и споласкивать гель 100 ml ультрачистой воды 20–60 секунд. Примечание: промывка геля больше минуты может вымыть ионы серебра, что может привезти к уменьшению чувствительности.
10) инкубировать гель в 100 ml проявляющего раствора 4–8 минут, пока зоны не начнут проявляться,
11) после достижения желаемой интенсивности зон, немедленно добавить 10 ml фиксирующего раствора прямо на гель, который еще находиться в проявляющем растворе. Осторожно перемешивать гель в течение 10 минут. Цвет раствора изменится от розового до бесцветного, что указывает на то, что проявка была остановлена,
12) вылить фиксирующий раствор и промывать гель 10 минут 100 ml ультрачистой водой.
Протокол обработки белков вгеле трипсином. Разделить гель по проявленным зонам, разрезать гель с разделёнными белками продольно на 24 кусочка и перенести каждый кусочек геля в отдельную пробирку:
1) в каждой пробирке разделить кусочки геля на две части,
2) промыть куски геля 100 µl смеси ацетонитрила и бикарбоната аммония (50 mM) в пропорции 50/50 и инкубировать, интенсивно встряхивая на мешалке на 10 минут,
3) убрать супернатант и добавить 100 µl ацетонитрила 100 %, встряхивать на шейкере 10 минут,
4) слить супернатант и повторить экстракцию ещё 2–3 раза,
5) высушить образцы на SpeedVac (около пяти минут).
Обработка трипсином.
6) добавить 20 µl активизированного трипсина (см. Ниже) в каждую пробирку. Инкубировать 15–20 минут при комнатной температуре,
7) добавить бикарбонат аммония (50 mM) чтобы покрыть кусочки геля. Инкубировать на ночь при температуре +37°С) центрифугировать (при комнатной температуре, 4000 об/мин).
8) Собрать супернатант с экстрагируемыми пептидами из геля при помощи epTip (VWR) и перелить в виалку,
9) добавить 20 µl смесь ацетонитрила и 5 % AF в пропорции 70/30 на кусочки геля. Инкубировать 20 минут при температуре +37°С,
10) отцентрифугировать и собрать второй раствор с экстрагируемыми пептидами, добавить в ту же виалку,
11) высушить на SpeedVac,
12) добавить 10 µl анализирующего раствора ацетонитрил/H2O/AFв пропорции 3/97/0,1.
Приготовление раствора трипсина. Взять 20 µg трипсина в виде порошка, добавить 1,4 mlHCL 1 mMи 100 µl ресуспензионного раствора. Растворить порошок и сделать аликвоты по 100 µl, хранить при -20°С. Концентрация трипсина 13,33 ng/ µl. Активизация трипсина. К 100 µl трипсина в концентрации 13,33 ng/ µl добавить 15 µl бикарбоната аммония (190 mM), затем смешать.
Реактивы. SDS, акриламид, бис-акриламида, TEMED, ацетонитрил, метанол (ВЭЖХ) были получены отSigma-Aldrich, Прага (Чешская Республика). Приборы для электрофореза были приобретены у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США). Муравьиная кислота, DTT, персульфат аммония, бикарбонат аммония и сульфат аммония были получены от Fluka Chemie (Buchs, Switzerland). Serva синий G и Serva неокрашенных ДСН маркерного белка 6,5–200 кДа были приобретены у SERVA (Гейдельберг, Германия). Трипсин был получен от Promega (Madison, WI, США). Все другие химические вещества были приобретены у PLIVA-Lachema (Брно, Чехия) и были аналитической чистоты.
Жидкостная хроматография (LC method). Pump: Thermo Scientific 600pump; column: Hypersil Gold C-18, 50x2.1mm, 1.9mcm; injection volume 10 mcl
Анализ на Mass-Spectrometer. Полученные пептиды были проанализированы с помощью nano-HPLC (AgilentTechnologies 1200), который непосредственно связан с ион-трап масс спектрометром (Bruker 6300 series), оборудованный источником с нано-электрораспылителем. Разделяющий градиент ацетонитрила от 5 % до 90 %, продолжительность 25 минут. Напряжение фрагментации 1,3 V. Ион-трап имеет последовательные наборы из 4 режимов сканирования, состоящий из: полностью сканирующей MS в диапазонах выше 200–2000 м/г, сопровождаемые тремя зависимыми от данных MS/MS сканерами из трех наиболее распространенных ионов при полном сканировании. Идентификация белков была проведена пакетом программного обеспечения MillSpectrum. Количественный анализ спектра и хроматограммы был проведён DataAnalysis для серии 6300 IonTrapLC/MS, версия пакета программного обеспечения 3.4. Относительное содержание каждого пептида в различных фракциях были определено путем сравнения площадей пиков с общей площадью ион хроматограммы (TIC) для этого пептида.
Таким образом, нами приведена методика подготовки образца для анализа и даны характеристики проведения идентификации белков. Эта методика одна из многих, но опробована и дает хорошие результаты. В своей работе принимали во внимание разработки других ученых (1–4).
Литература:
- Conrath U. (2006). Systemic acquired resistance. Plant signaling & behavior, 1(4), 179–184. https://doi.org/10.4161/psb.1.4.3221
- Smith, B. J. (1984). SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Proteins, 41–56. doi: 10.1385/0–89603–062–8:41
- Shiker, Mushtak. (2012). Multivariate Statistical Analysis. British Journal of Science. 6. 55–66.
- Damodaran, S., Wood, T. D., Nagarajan, P., & Rabin, R. A. (2008, February 8). Evaluating Peptide Mass Fingerprinting-based Protein Identification. Retrieved from https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022908600029?via=ihub
