Внутривидовая трансформация у Cl. Perfringens

Внутривидовая трансформация у Cl. perfringens стала возможной с одним штаммом D (213), компетентные клетки которого воспринимали ДНК от других типов и штаммов Cl. perfringens — B (LD-1), B (LD-4), D (91), D (213), D (218). Cl. perfringens D (213) воспринимал ДНК и трансформировался как от собственного, гомологичного штамма, так и от негомологичных штаммов других типов. Сохраняемость индуцируемой устойчивости трансформантов проверяли путем нескольких пассажей на жидкой питательной среде без антибиотика, с последующим посевом на плотную среду с концентрацией стрептомицина — 1000 ед/мл. При этом отмечалось наследственное закрепление резистентности к антибиотику — от 4-х — 6-ти месяцев до 2-х лет. Затем происходила утрата устойчивости и возвращение к исходному. Следовательно, устойчивость бактерии к антибиотикам не является тупиковым состоянием, и те антибиотики, которые стали непригодными, после реверсии с успехом можно применять для лечения; к тому же человечество лучшего средства против инфекционных заболеваний пока еще не создало.

Ключевые слова: ДНК, клетка, частота трансформации, глюкозо-кровяной агар, концентрация стрептомицина, концентрация ДНК, антибиотик, штамм, внутривидовая трансформация, поверхность агара, трансформация.

Между бактериями найдено несколько способов передачи биологических свойств — трансформация, конъюгация и трансдукция. Трансформация — когда перенос различных свойств осуществляется свободной ДНК, выделенной из клеток донора. В результате появляются рекомбинанты (трансформанты) — клетки, принявшие от донора те или иные детерминанты (биологические свойства).

Для выделения ДНК использовали стрептомициновые мутанты (резистентные к высоким концентрациям стрептомицина) Cl. perfringens В (LD-1) M, D (213) M и D (218) M. В качестве реципиентов брали исходные штаммы типа В (LD-1), В (D-4), D (91), D (213) и D (218). Из пяти штаммов, взятых в качестве реципиентов, способных к трансформации оказался только один — Cl. perfringens D (213). Стрептомициноустойчивые варианты выделяли методом Г. Кудлай (1950), Сцибальского и Бринзона (1952). С помощью этих методов были получены варианты Cl. perfringens, устойчивые к следующим концентрациям антибиотика: B (LDI-1) — к 10000 ед/мл и D (213, 218) — к 12000 ед/мл. Эти штаммы использовались в качестве доноров.

Изолирование ДНК проводили по методике Мармура (1961). В методике опускали добавление лизоцима, достаточно было замораживание до -3, -5^оC на 18–24 часа и добавление додецилсульфата натрия. Депротеинизацию лизированной культуры проводили хлороформизоамиловым спиртом. Нуклеиновые кислоты осаждали этиловым спиртом. ДНК не освобождали от РНК, с той целью, чтобы не травмировать молекулы ДНК. ДНК растворяли в 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат Na, а также в физиологическом растворе NaCl.

Компетентные клетки реципиентов получали охлаждением при +4⁰С на 16–18 часов. Это делалось для того, чтобы слегка повредить оболочку реципиентных клеток для облегчения проникновения донорной ДНК.

Таблица 1

Внутривидовая трансформация уCl. Perfringens

Как видно из таблицы 1, штамм Cl. perfringens типа D (213) воспринимал ДНК и трансформировался как от собственного гомологичного штамма, так и от негомологичных штаммов других типов Cl. perfringens. При нескольких повторностях опыта трансформацию получали только со штаммом D (213). При сравнении опытных и контрольных чашек отмечали рост единичных колоний на контрольных чашках. но их число было на несколько порядков ниже опытных. Число трансформантов намного превышало число спонтанных мутантов.

Таблица 2

Трансформация со штаммом Cl. perfringens D (213)

Сохраняемость индуцируемой устойчивости трансформантов проверяли путем нескольких пассажей на жидкой питательной среде без антибиотика с последующим посевом на плотную среду с концентрацией стрептомицина 1000 ед/мл. При этом отмечалось наследственное закрепление резистентности к антибиотику. Частоту трансформации мы определяли, исходя из общего числа жизнеспособных клеток в 1 мл питательной среды. Из таблицы 2 видно, что частота трансформации 3 х 107 жизнеспособных клеток составила 0,0035 %; этот показатель, в основном, сохранялся и в других опытах при изучении оптимальных условий трансформации.

Зависимость частоты трансформации от концентрации донорной ДНК

Частота трансформации зависит от концентрации ДНК. Выход трансформантов увеличивается линейно с повышением концентрации ДНК до определенного уровня, за которым следует понижение образования трансформантов. Исходя из предварительных опытов выбрали следующие уровни концентрации ДНК — 0,2; 0,4; 0,7; 1,5; 3 и 5 мкг/мл.

Компетентные клетки получали двумя способами — охлаждением и замораживанием. Замораживание вели при -70⁰С на 10 минут, охлаждение — при +4⁰С на 16 часов. К замороженным культурам после оттаивания при 37⁰С добавляли ДНК str ^r штамма D(213) М в указанных концентрациях, также поступали и с охлажденной пробой. Количество жизнеспособных клеток в замороженной культуре было — 8х10⁶ на мл, в охлажденной — 2х10⁷ клеток на мл. Действие ДНК прерывали ДНК-азой после 30-минутной инкубации. Пробы как опытные, так и контрольные инкубировали дополнительно 4 часа, затем по 0,2 мл инокулята наносили на поверхность глюкозо-кровяного агара с концентрацией стрептомицина 1000 ед/мл. Чашки инкубировали в анаэростатах при температуре 37⁰С в течение 44 часов.

Результаты опыта на трех повторностей приведены в таблице 3.

Таблица 3

Зависимость частоты трансформации от концентрации ДНК

Сравнительные исследования трансформации на жидкой итвердой питательных средах

Культура исходного штамма Cl. Perfringens D (213) 18-часового роста на МППБ переносилась в свежий бульон Китт-Тароцци и инкубировалась 4 часа; после этого срока культуру разбавляли 1:10 минимальной средой, инкубировали дополнительно 1 час, а затем охлаждали до +4⁰С на 16 часов, затем использовали для трансформации.

Посевы проводились на глюкозо-кровяном агаре без стрептомицина. В одну серию чашек ДНК и компетентные клетки смешивались непосредственно на поверхности агара следующим образом. Перед посевом культуры на поверхность агара наносили одну каплю ДНК в концентрации 800 мкг/мл и втирали с помощью шпаделя; сюда же добавляли компетентную культуру — 0,05 мл; таким образом непосредственно на поверхность агара смешивались ДНК и компетентные клетки реципиента.

Параллельно бульонную культуру компетентных клеток смешивали с ДНК в пробирке (0,1 мл ДНК + 0,9 мл культуры) при концентрации ДНК 1,6 мкг/мл. Смесь ДНК и компетентная культура инкубировалась 20 минут, а затем добавляли ДНК-азу в концентрации 50 мкг/мл, инкубировали еще 4 часа и смесь высевали в другую серию чашек — глюкозо-кровяной агар без антибиотика в объеме 0,05 мл.

В опыте были использованы следующие контроли: 1) компетентные клетки + буфер; 2) ДНК инактивированная ДНК-азой + компетентные клетки; 3) только компетентные клетки для подсчета жизнеспособных особь и 4) контроль на стерильность ДНК.

Все чашки с обеих серий опыта инкубировались в анаэростатах при 37⁰С в течение 20 часов, затем с каждой чашки снимали отпечатки методом реплик по Ледербергу (1952) на селективную среду (глюкозо-кровяной агар с концентрацией стрептомицина 1000 ед/мл). Колонии, выросшие на исходных чашках, переносились на лоскут бархата путем легкого прижимания к поверхности агара с выросшими колониями на ткань; затем на бархат с отпечатанными колониями накладывали чашки со свежей селективной средой (глюкозо-кровяной агар со стрептомицином 1000 ед/мл), таким образом получали втричные чашки-реплики, которые инкубировали в анаэростатах при 37⁰С в течение 48 часов.

В трех повторносей приводим результаты одного опыта без изменений, так как существенной разницы в частоте трансформации не наблюдали. Для каждой серии опытов приводим таблицы отдельно, чтобы более наглядно представить разницу (см. Таблицы 4 и 5).

Таблица 4

Трансформация втвердой среде сприменением метода реплик (1)

Таблица 5

Трансформация вжидкой среде сприменением метода реплик (2)

Для всех исследований р< 0,001 Примечание: число жизнеспособных клеток — 9х10⁶ на мл

Из этих таблиц (4, 5) видно, что трансформация более интенсивно идет в жидкой среде, причем прекращение действия ДНК ДНК-азой после 20-минутного контакта с компетентной культурой увеличивает выход трансформантов. Однако, существенной разницы в частоте трансформации в обоих сериях опытов нет; в первом случае она составляет 0,005 и во втором — 0,008. Следует отметить, что трансформация на твердой среде очень удобна для проверки биохимической активности ДНК, а также для выявления новых трансформабельных штаммов.

Таким образом, трансформация на твердой среде является удобной. Для Cl. perfringens метод реплик в осуществлении трансформации как в жидкой, так и в твердой средах, а также как в аэробных, так и в анаэробных условиях представляется очень удобной, так как стадия необратимого поглощения клетками ДНК происходит успешно в обоих указанных условиях их культивирования.

Стрептомицинорезистентность и гемолитические свойства, помимо локализации в плазмидной ДНК, включены в хромосому клетки клостридий и эти два признака чаще переносятся совместно, т. к. при замораживании они не элиминируются и переносятся в клетки реципиента участки хромосомы, в которой локализованы.

Что касается устойчивости к стрептомицину, ее можно обобщить и сделать заключение, что устойчивость к антибиотикам сохраняется от 4-х — 6-ти месяцев до 2-х лет, затем возвращается к исходному состоянию — универсальный закон всех живых организмов. Однако, то время когда бактерии являются резистентными (мутанты) к антибиотикам, превращает их непригодными для лечения, но все же устойчивость бактерии к антибиотикам не является состоянием тупиковым — происходит реверсия мутантных клеток, возврат к изначальному состоянию.

Внутривидовая трансформация намного уступает конъюгации, она осуществлется между далеко стоящими (на таксономической лестнице, видами и родами, бактерий, E.coli, стафилококки, стрептококки и др. — трансформация же происходит, преимущественно, внутри вида, этому способствует то, что плазмидная ДНК, в процессе выделения хромосомной ДНК-элиминируется, переносятся те признаки, которые связаны с хромосомой — резистентность к антибиотикам и гемолитическая активность. Элиминации плазмидной ДНК способствует и додецилсульфат натрия, применяемый при выделении ДНК.

У Cl. perfringens токсигенность несет плазмидная ДНК, т. е. токсигенные свойства определяет плазмида. так или иначе, передача антибиотикорезистентности настолько важна для макроорганизма, что при внедрении в организм возбудителя, многие антибиотики непригодны по назначению, но среди множества антибиотиков можно выбрать пригодный для лечения; вместе с этим хочу отметить следующее — человечество лучшего средства для лечения инфекционных заболеваний не создало.

1. ДНК, выделенная из стрептомицинорезистентного варианта Cl. perfringens; ДНК осаждена этанолом (верхний слой), переносится в жидкость следующего состава: 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрат Na, также в физиологическом растворе NaCl — ДНК моментально растворяется.

2. Ультраструктура исходнoй культуры Cl. perfringens D (213) х 80000, без воздействия стрептомицина

3. Колонии авирулетного стрептомицинорезистентного варианта Cl. perfringens D (213) на глюкозном агаре

4. Ультраструктура авирулентного стрептомицинорезистентного варианта Cl. perfringens штамм D (213) х 80000.

5. Ультраструктура трансформированного варианта Cl. perfringens штамма D (213) х 80000

6. Колонии трансформантов Cl. perfringens штамма D (213) на глюкозно-кровяном агаре

7. Колонии трансформантов Cl. perfringens штамма D (213) на глюкозно-кровяном агаре

Представленные фотоснимки свидетельствуют о том, что антибиотик в высоких концентрациях, при длительном воздействии, превращает клетки Cl. perfringens в R-форму. Сравнивая с исходной клеткой, хромосома (нуклеоид) мутантной клетки фрагментирован, и ДНК, выделенная из таких клеток и внесенная в суспензии исходных клеток, вызывает подобные изменения нуклеоида, — происходит трансформация; некоторые клетки с гемолизом. Эти два признака передаются совместно, но более с высокой частотой — устойчивость к антибиотику. Они локализованы в локусах нуклеоида на близком расстоянии. Что касается токсигенности, она локализована в плазмидной ДНК, которая содержится в цитоплазме автономно и при воздействии замораживания, додецилсульфата натрия, либо антибиотика — происходит элиминация ее. Поэтому при трансформации токсигенность не передается; передача возможна при применении более щадящих методов выделения ДНК.

Литература:

1. Начкебия Д. В. Влияние антибиотиков на свойства возбудителей анаэробных инфекций //Ветеринария, № 9, 1972.
2. Начкебия Д. В. Изучение трансформации у микроорганизмов Cl. perfringens //Ветеринария, № 6, 1973.
3. Начкебия Д. В. Влияние некоторых физических и химических факторов на свойства Cl. perfringens //Бюлл. ВИЭВ, в.ХVI, 1973.
4. Кудлай Д. Г. Резистентность к стрептомицину брюшно-тифозных бактерий //В сб. тр. Акад. Мед. Наук СССР, 1980, с. 63.
5. Спирин А. С. Биохимия, т.23, с.656, 1958.
6. Тришкина Е. Т. Методы оценки устойчивости микроорганизмов к антибиотикам //Бюлл. ВИЭВ, 1970, в. 8, с. 99.
7. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Molec. Biol., 1961, 3, 208.
8. Szybalski W., Brjson V. J. bacteriol, 1952, 64, 489.
9. Lederberg E. M., Cohen S. N. Transformation of typhimurium bi plasmid deoxyribonucleic acid // J. Bact. — 1974. — v. 119. — 1072–1075.