В данной работе проводится анализ подбора режима работы сканирующего (растрового) электронного микроскопа в исследованиях биологических образцов: эритроцитов крови в норме и патологии для формирования новых подходов в методах изучения и диагностики заболеваний. Рассматриваются изображения эритроцитов крови пациентов с заболеваниями почек с гематурией, которые в настоящее время диагностируются методом биопсии. Приводится описание подготовки образцов, сравнение режимов работы в исследованиях морфологии эритроцитов. Получены условия проведения эксперимента для повышения качества изображений, позволяющие получить достоверную информацию о морфологии эритроцитов. Результаты исследования могут лечь в основу рекомендаций проведения экспериментов с биологическими образцами человека для формирования новых подходов в методах клинической лабораторной диагностики.
Ключевые слова: электронная микроскопия, лабораторная диагностика, гематурия, гломерулонефрит, морфология эритроцитов, сканирующий электронный микроскоп, качество изображения.
Введение
В настоящее время является актуальной проблема дифференциальной диагностики гломерулонефритов, в том числе сопровождающихся гематурией, для установления клинико-морфологической формы которых применяется почечная биопсия, сопровождающаяся высокими рисками для пациента. Ранее авторы представляли к публикации работы, связанные с исследованием образцов крови детей с заболеваниями почек с синдромом гематурии, например, такими как IgA-нефропатия, хронический гломерулонефрит, гемморагический васкулит [1, 2]. Исследования сухих мазков крови методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) позволили сделать выводы о том, что, несмотря на то, что на морфологию эритроцитов крови влияет очень большое количество факторов, существует некоторая связь их форм и размеров с диагнозом заболевания. Связь с диагнозом обнаружена также у количественных и качественных характеристик нанообъектов (НО) на их поверхности эндогенного происхождения, но неясного биогенеза, которые имеют линейные размеры, сопоставимые с размерами вирусов и экзосом.
В ходе изучения образцов крови пациентов проводилась экспериментальная работа по выявлению условий проведения исследования, связанной с подготовкой биообразцов и режима работы электронного микроскопа. Очевидно, что при правильном выборе условий проведения экспериментов получались наиболее качественные изображения, которые позволяли делать анализ морфологии эритроцитов крови на нанометровом уровне. Возможно, исследование особенностей морфологии эритроцитов методом СЭМ у пациентов с различными видами гломерулонефритов позволит сформировать новые подходы в их дифференциальной диагностике. Учитывая необходимость обработки при этом большого количества данных и связанные с этим проблемы их оптимального использования существует необходимость разработки метода машинного обучения в исследованиях форм и размеров эритроцитов, НО СЭМ-изображений. Автоматизация распознавания образов эритроцитов и НО существенно облегчит анализ морфологических данных образцов крови и будет способствовать формированию подходов в разработке методов дифференциальной диагностики заболеваний почек. Для машинного анализа морфологических данных образцов крови необходимо проводить подготовительные работы по оконтуриванию эритроцитов (рис. 1). Качество таких работ, в свою очередь, зависит от качества СЭМ-изображений.
Рис. 1. Оконтуривание эритроцитов, увеличенных в 1000 раз с помощью программы Anaconda prompt (Anaconda 3)
Таким образом, целью данной работы является анализ полученных СЭМ-изображений для установления оптимального режима проведения экспериментов на СЭМ образцов крови человека для выработки практических рекомендаций.
Материалы иметоды исследования
В данной работе рассматривается исследование крови тонких сухих мазков крови с толщиной, примерно сопоставимой толщиной одного эритроцита (1–2 микрон), на предметном стекле пациентов с хроническим мезангиопролиферативным гломерулонефритом (ХМПГН) и пациента без признаков иммунного поражения почек методом СЭМ. Забор крови этих пациентов и эксперименты с применением СЭМ были проведены пять раз в течение года. Эксперимент был начат с мая 2019 года и был завершен в декабре 2019 года. Забор крови был реализован пять раз: в мае, июне, сентябре, ноябре и в декабре 2019 г., т. е. более-менее равномерно в течение одного года. Кровь брали одновременно у обоих пациентов. Исследования проводились на растровом электронном микроскопе JSM-7800F JEOL с разрешающей способностью 1,2 нм (при 1 кВ) с системой Gentle Beem в режиме низких ускоряющих напряжений (1–2 кВ) без проводящих покрытий образцов. При данном исследовании рассматриваются CЭМ-изображения, полученные путем детектирования вторичных электронов с образцов с помощью нижнего детектора микроскопа. Такие ускоряющие напряжения и работа в режиме торможения пучка «Gentle Beam» позволяют не покрывать поверхность образцов проводящим слоем, что увеличивает возможности улучшения качества изображения при таких низких ускоряющих напряжениях и с одновременным применением системы торможения электронов пучка непосредственно перед их падением на исследуемый образец [3].
Результаты и анализ исследования
На рис. 2 представлены изображения эритроцитов и их поверхности с большим количеством нанообъектов пациента с диагнозом ХМПГН в июне 2019 г. при различных увеличениях. Данные этого эксперимента показали, что края выбранного эритроцита неровные и его поверхность при увеличении более чем 10 000 раз не гладкая и имеет включения в виде ямок, впадин и светлых нанометровых объектов (НО). Размер НО на поверхности эритроцитов варьируется от 30 нм до 100 нм. На основе рис.2 было выявлено, что наибольшее количество НО имеет размер 50–70 нм. Данные снимки были сделаны при следующем режиме работы СЭМ: 1) ускоряющее напряжение равнялось 1,00 кВ; 2) рабочее расстояние — WD равнялось 4,0 мм.
а) б)
в) г)
Рис. 2. СЭМ-изображения капиллярной крови пациента с ХМПГН: 1) эритроцитов — а) и б) при увеличениях 1000х и 10 000х соответственно; 2) НЧ — в) и г) при увеличениях 20 000х и 40 000х соответственно.
На рис. 3 представлены эритроциты и НО на их поверхности образца крови пациентки с ХМПГН, забор которого был сделан в декабре 2019 г. Данные снимки были сделаны при следующем режиме работы СЭМ: 1) ускоряющее напряжение равнялось 1,00 кВ; 2) рабочее расстояние (фокусное расстояние) — WD равнялось 3,9 мм. Изменение WD позволило получить снимок при увеличении 80 000 раз, что было невозможно при WD равном 4,00 мм.
а) б)
в) г)
Рис.3. СЭМ-изображения капиллярной крови пациента с ХМПГН: 1) эритроцитов — а) и б) при увеличениях 1000х и 10 000х соответственно; 2) НЧ — в) и г) при увеличениях 22 000х и 80 000х соответственно.
Из рис., 4 видно, что есть отличия в морфологии эритроцитов крови контрольного образца от морфологии эритроцитов образца крови пациента с ХМПГН. Снимки были сделаны при условиях: 1) ускоряющее напряжение равнялось 1,00 кВ; 2) рабочее расстояние (фокусное расстояние) — WD равнялось 3,7 мм. В отличие от имеющих круглые формы НЧ пациента с ХМПГН НО имеют размытые формы, хлопьеобразны. Такие хлопьеобразные НО наблюдались на поверхности эритроцитов крови больных раком шейки матки после того, как образцы крови c эритроцитами с НО подвергали шоковой заморозке путем охлаждения их до температуры жидкого азота [4].
а) б)
в) г)
Рис. 4. СЭМ-изображения контрольного образца капиллярной крови: 1) эритроцитов — а) и б) при увеличениях 1000х и 10 000х соответственно; 2) НО — в) и г) при увеличениях 20 000х и 40 000х соответственно.
На рис. 5 показаны изображения эритроцитов при одинаковом увеличении и ускоряющем напряжении, но при различных значениях фокусного расстояния.
а) б)
в) г)
Рис.5. СЭМ-изображения капиллярной крови пациента с ХМПГН: 1) эритроцитов — а), б), в), г) при увеличениях 10 000х и 
, 
, 
соответственно
Необходимо отметить, что сравнение СЭМ-изображений при равных режимах работы кроме изменения рабочего расстояния WD показывает, что изображения поверхности эритроцитов заметно отличаются. Видно, что небольшое отклонение в 0,1 мм для WD приводит к получению разной информации от изображений. Например, из рис. 4 в) и с) видно, что, когда , видимо, изображение НО размывается из-за отклонения от оптимальной фокусировки в данных исследованиях. И вместо НО с достаточно выраженными формами в виде круглых фигур получаются изображения НО с размытыми контурами. А наиболее оптимальным условием для рабочего расстояния при низком ускоряющем напряжении 1 кВ является, когда (рис.5 б), хотя при увеличении в 10 000 раз при и нет существенной разницы в качестве изображения, но 80 000 увеличение возможно только для без потери качества изображения для НО на поверхности эритроцитов. Еще раз необходимо отметить, что при условии есть возможность получить изображения НО при увеличении в 80 000 раз. И в то же время из рис. 3 г) видно, что при поверхность эритроцитов уже при 1 000 увеличении кажутся идеально гладкими, ровными и на них не видно никаких НО.
Полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа изображения возможно обработать с помощью методов машинного зрения. Например, такие методы имеются в программном обеспечении LabView2013 фирмы National Instruments [5]. При обработке изображений из-за не оптимально подобранных параметров СЭМ возникает проблема с оконтуриванием или по другому выделением нанообъектов и эритроцитов. Выделение эритроцитов проводится при увеличении примерно равном 1000 раз. Благодаря использованию программы возможно точно и быстро посчитать количество дисморфных эритроцитов и НО.
На рис. 6 представлена обработка изображения рис. 3 в). Видно, что после обработки четко выделены НО, черным цветом, относительно всего фона. Как видно из рисунка, после обработки ямки на исходном изображении выделяются черными точками с очень малым размером. В дальнейшем возможно произвести фильтрацию для удаления мелких шумовых объектов. Благодаря выделению в дальнейшем можно произвести подсчет количества НО и их сортировку по размерам.
а) б)
Рис. 6. Снимки до обработки a) и после обработки б) СЭМ изображения при WD=3,9 мм
На рис. 7 представлена обработка изображения рис. 4 в). Изначально видно, что на снимке имеются хлопьевидные объекты на поверхности эритроцита. Но при обработке из-за плохого качества снимка некоторые объекты не выделятся программой. Особенно это видно по краям эритроцита. Конечно, процент потерь не велик. Но также появляются объекты, которые невозможно считать НО, проколы и ямки. При обработке эти объекты закрашиваются черным с размером сопоставимым с НО, что недопустимо.
а) б)
Рис. 7. Снимки до обработки а) и после обработки б) СЭМ изображения при WD=3,7 мм
Эти два изображения получены при увеличениях примерно в 20 000 раз. На рис. 8 представлена обработка изображения при увеличении в 80 000 раз. Видно, что при таком изображении намного четче выделяются НО и шумы изображений почти исчезают из-за больших отличий в размерах.
а) б)
Рис. 8. Снимки до обработки а) и после обработки б) СЭМ изображения при WD=3,9 мм и увеличении 80 000х
На основании произведенных обработок СЭМ изображений наглядно показано, что подбор оптимальных параметров при измерении мазков крови позволяют получить более обширную и достоверную информацию.
Заключение
Для данной модификации сканирующего электронного микроскопа при проведении экспериментов с образцами крови в виде сухих мазков на предметном стекле необходимо работать при низком ускоряющем напряжении 1 кВ без напыления проводящего слоя на образец с использованием нижнего детектора вторичных электронов, с активацией системы «Gentle Beam» и с выбором рабочего расстояния .
Таким образом, для определения подходов в выборе параметров в разработке метода дифференциальной диагностики различных видов гломерулонефритов с применением СЭМ на основе исследования морфологии эритроцитов крови на примере эксперимента с образцом крови пациента с ХМПГН необходимо обратить внимание на то, что существует зависимость качества изображения от четкого определения режима работы СЭМ с учетом большого влияния WD на него. Качество изображений влияет на проведение анализа морфологии эритроцитов, что в свою очередь будет определять подход в разработке метода дифференциальной диагностики видов гломерулонефритов с учетом того, что качество изображения влияет на определение вида и степени дисморфии эритроцитов, что является важной информацией в изучении заболевания, выявления особенностей его проявления на клеточном уровне.
Литература:
- Maksimov, G.V., Mamaeva, S.N., Antonov, S.R., Munkhalova Ya.A., Kononova, I.V., Sheikin, I.Yu. Measuring Erythrocyte Morphology by Electron Microscopy to Diagnose Hematuria //Measurement Techniques. June 2016. Volume 59 (3). pp 327–330.
- Мамаева С. Н., Максимов Г. В., Мунхалова Я. А., Антонов С. Р., Дъяконов А. А., Винокуров П. В. Исследование эритроцитов крови с заболеваниями почек с синдромом гематурии с использованием растровой электронной и атомно-силовой микроскопии //Медицинская физика. 2017. № 1 (73), С.58–62.
- Растровая электронная микроскопия для нанотехнологий. Методы и применение [Электронный ресурс] / под ред. У. Жу, Ж. Л. Уанга; пер. с англ. — Эл. изд. — М.: БИНОМ. Лабаратория знаний, 2013. — 582 с. (здесь тоже добавьте, пожалуйста литературу)
- С. Н. Мамаева, Г. В. Максимов, С. Р. Антонов, В. А. Платонова, А. С. Гольдерова, И. В. Кононова, Я. А. Мунхалова, Н. А. Николаева, Т. М. Лебедева «Изучение действия низких температур на морфологию эритроцитов крови детей с гематурией методами оптической и электронной микроскопии» // Ж. Медицинская физика, № 3 (83), 2019 г. С.75–82.
- Визильтер Ю. В., Желтов С. Ю., Князь В. А., Ходарев А. Н., Моржин А. В. Обработка и анализ цифровых изображений с примерами на LabVIEW IMAQ Vision. — М.: ДМК Пресс, 2007. — 464 с.
