В статье авторы пытаются изучить различные методы определения тиолов с целью определения наиболее доступного в практической деятельности.
Ключевые слова: предел обнаружения, кислота, нижняя граница, кровь, оптическая плотность, электрод.
Биологически-активные серосодержащие соединения (БАСС), такие как глутатион, цистеин, метионин, а-липоевая кислота содержащие тиоловые группы (SH- группы) играют важную роль в физиологических и биохимических процессах в организме человека.
Исследование соединений, содержащих SH-группы имеет большую диагностическую ценность. Многочисленные исследования показывают, что по концентрации тиолов в биологических жидкостях можно судить о заболеваниях человека и метаболических нарушениях, связанных с окислительным стрессом.
В связи с этим актуальным представляется изучить различные различные методы определения тиолов с целью определения наиболее доступного в практической деятельности.
Известно достаточно много методов определения тиоловых соединений в разных объектах искусственного и природного происхождения. В настоящее время их можно разделить на следующие группы:
1. спектральные, 2. электрохимические, 3. хроматографические методы.
Спектральные методы
Наиболее широко распространенным методом определения тиолов в тканях до сих пор является спектрофотометрический метод, основанный на использовании 2-нитробензойной кислоты) (DTNB), предложенный Эллманом. Преимущества этого метода заключаются в быстроте и хорошей воспроизводимости, а главные недостатки связаны с низкой чувствительностью
Вначале определяли общее содержание SH-групп в образцах.
Для этого пробы инкубировали 30 мин в темноте в присутствии 1 мМ DTNB и 17,3 мМ(0,5 %) додецилсульфата натрия (SDS). Затем с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность. Из полученных значений вычитали оптическую плотность образца с SDS и оптическую плотность DTNB и SDS в отсутствие биологического материала. Концентрацию SH-rpynn рассчитывали, исходя из известного коэффициента молярной экстинкции.
Для определения содержания небелковых SH-групп пробу тщательно смешивали с охлажденной 5 %-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и оставляли на льду на 15 мин, затем центрифугировали 5 мин при +4°С. Отобранный супернатант нейтрализовали с помощью 1 %-ного NaOH и инкубировали с 0,1 мМ DTNB в темноте 30 мин. Содержание небелковых SH-rpynn определяли по оптической плотности и рассчитывали на мг белка.
Существует флуориметрический метод оценки содержания глутатиона по восстановлению орто-фталевого альдегида, применение которого ограничено способностью индикатора реагировать с первичными аминами. В последнее время появился новый реагент для определения тиогрупп ThioGlo-1, обладающий рядом преимуществ. ThioGlo-1 реагирует как с GSH, образуя флуоресцирующее соединение в течение нескольких секунд, так и с SH-содержащими белками (при этом реакция может проходить в течение нескольких часов).
Среди ферментативных способов анализа можно отметить методы с использованием фермента- глутатионтрансферазы (колориметрическое определение нитрита, выделяющегося при ферментативной коньюгации глутатиона с ортодинитробензолом, и глиоксилазы, кт глутатион-зависимое восстановление метилглиоксаля до S-лактоилглутатиона.
Электрохимические методы
Электрохимические методы для определения тиолсодержащих веществ представлены многообразием вольтамперометрических и амперометрических методик.
Хроматографические методы
Самыми чувствительными методами для определения тиоловых соединений являются методы ВЭЖХ с разными способами детектирования. Так как хроматографические методы по своей сути- это методы с разделением,главным образом они ориентированы на определение индивидуальных компонентов антиоксидантной системы.
В работе предложен метод ВЭЖХ определения метионина в плазме крови человека амперометрическим способом детектирования. 2
Хроматографические методы нельзя отнести к ряду простых способов определения тиолсодержащих веществ в биологических объектах. Это довольно труднозатратный анализ имеющий большие погрешности.
Среди представленных методов,наиболее возможными для определения органических тиолов являются спектрофотометрические методы. Благодаря низкой стоимости и простоте выполнения анализа,эти методы до сих пор используются в научной и практической деятельности.Они удобны для сравнительного изучения изменений содержания SH групп в крови в норме и патологии.
Отклонения в тиол-дисульфидном гомеостазе может играть существенную роль в качестве биомаркера в развитии патофизиологических состояний.
Литература:
- Яковлев, А. А. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИОЛОВЫХ ГРУПП В ТКАНИ МОЗГА ПРИ ПОМОЩИ THIOGLO-1 / А. А. Яковлев, Н. В. Гуляева. — Текст: непосредственный // Биомедицинская химия,. — 2004. — №. — С. 390–393.
- КУДАЕВА, И. В. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА В ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКЕ / И. В. КУДАЕВА, Л. Б. МАСНАВИЕВА. — Текст: непосредственный // МЕДИЦИНСКИЙ АЛФАВИТ. — 2015.
