Спонтанная пролиферативная и иммуноглобулинсинтезирующая активность В-лимфоцитов при анкилозирующем спондилоартрите

Введение

Анкилозирующий спондилоартрит (АС) – хроническое воспалительное заболевание с поражением периферических суставов и позвоночника, приводящее в процессе прогрессирования к анкилозированию и потере функциональной активности больных. Большое значение имеет наследственная предрасположенность, генетическим маркером которой является антиген HLAB₂₇, встречающийся у 90-95% больных [1,2].

Ведущее значение в иммунопатогенезе АС имеет гиперактивация В-системы иммунитета, проявляющееся накоплением циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), разнообразных антител к соединительнотканным структурам [4].

При этом особое место в оценке В-системы иммунитета занимают метод изучения пролиферативной и иммуноглобулинсинтезирующей функции периферических лимфоцитов, позволившее, в частности установить высокую спонтанную пролиферативную и иммуноглобулинсинтезирующую активность В-лимфоцитов при ревматических заболеваниях [4-7].

Цель исследования – изучить спонтанную пролиферативную и иммуноглобулинсинтезирующую активность В-лимфоцитов при АС.

Материалы и методы

Нами обследовано 36 больных АС (32 мужчин и 4 женщин) в возрасте от 18-40 лет. Длительность заболевания до 1 года была у 6 больных, от 1 до 5 лет – у 8 больных, от 5 до 10 лет – у 12, более 10 лет болели 10.

В качестве сравнительной группы исследованы 22 больных остеоартрозом (ОА), 19 – реактивным артритом (РеА), 28 – ревматоидным артритом (РА) и 18 – системной красной волчанкой (СКВ).

В качестве контрольной группы выступали 30 абсолютно здоровых доноров из числа студентов медицинского факультета Ошского государственного университета.

Определение спонтанной пролиферативной активности В-лимфоцитов (СПАЛ) проводилось оригинальным методом количественной цитофлюорометрии, основанном на определении степени активности ядерного хроматина лимфоцитов по способности активных участков нуклеиновых кислот ядра лимфоидной клетки поглощать из раствора акридиновый оранжевый (АО).

СПАЛ определяли следующим образом.

Лимфоциты выделяли общепринятым методом на градиенте плотности 1,007 г/см³верографин-фиколл. Выделенные лимфоциты отмывали еще 1 раз средой 199, путем центрифугирования при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут, затем ресуспендировали в 3-4 каплях среды 199, доводя концентрацию клеток до 4-5х10⁶/мл. Исследование пролиферативной функции лимфоцитов проводили в монослойных культурах, созданных на предметных стеклах. Каплю густой свежевыделенной суспензии лимфоцитов наносили на 2 чистых обезжиренных предметных стеклах (контроль и опыт), инкубировали во влажной камере при комнатной температуре 3-5 мин. После чего не прилипшие клетки смывали средой 199. В результате на стекле оставалось четко сформированное пятно клеточного монослоя жизнеспособных клеток. Затем стекла со сформированным монослоем лимфоцитов, не допуская высыхания, сразу же помещали в камеры для культивирования с полной питательной средой (ППС), состоящей из среды 199 с добавлением гентамицина (0,08 мг/мл. Затем в обе культуры лимфоцитов (контроль и опыт) добавляли В-клеточныймитоген – ЛПС 5 мпд/мл производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея. После чего камеру с контрольной культурой лимфоцитов немедленно помещали в холодильник при t=4⁰С, а камеру с опытной культурой – в термостат при t=37⁰С с влажной камерой. Камеры инкубировали 2 часа. Затем стекла вынимали, ополаскивали в среде 199, фиксировали 15 мин 70% раствором этанола. Затем мазки окрашивали 0,001% акридиновым оранжевым (АО). Рабочий раствор АО готовили в день опыта из маточного раствора АО концентрации 1:1000, разводя его цитратным буфером до концентрации 1:100000. Затем препарат промывали 10 минут в чистом цитратном буфере, подсушивали и измеряли уровень флюоресценции лимфоидных клеток методом количественной цитофлюорометрии (КЦФ). КЦФ проводили оригинальным методом на базе микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ, используя фотометрическую приставку ФМЭЛ-1 [3]. Цитофлюорометрию лимфоидных клеток, окрашенных АО, осуществляли следующим образом. На произвольный участок препарата при невозбуждающем освещении фокусировали объектив фотометра, в котором был предварительно убран один из микрозондов с целью обеспечения измерения со всей площади объектива. После фокусирования объектива устанавливали положение, соответствующее убранному микрозонду, заменяли светофильтр на возбуждающий и замеряли интенсивность флюоресценции в области 640 нм; выделяя эту область интерференционным светофильтром, встроенным в фотометр. После регистрации результата, поворотом диска заменяли интерференционный фильтр на другой и замеряли флюоресценцию в области 530 нм. Вся процедура непосредственных измерений занимает 20-30 секунд, что практически устраняет эффект фотодеструкции АО.

Полученные результаты выражали отношением флюоресценции (Ф) комплекса АО с РНК (640 нм) к комплексу АО с ДНК (530 нм). Данное соотношение (Ф640/Ф530) известно как параметр А, отражающий степень активности ядерного хроматина клеток. Таким образом, определяли соотношение РНК/ДНК ядерного хроматина, которое закономерно изменяется в ходе активации лимфоцитов. Сравнивая уровень параметра А в контроле и опыте, выводили показатель СПАЛ по формуле: СПАЛ=(А опыт:А контроль)х100усл.ед. За положительный результат принимали значение превышающее максимальное значение доверительного интервала у здоровых лиц, по формуле М±σ (где σ – среднее квадратичное отклонение), т.е. значение СПАЛ равное 125 усл.ед. и более.

Определение спонтанной иммуноглобулинсинтезирующей активности В-лимфоцитов (СИАЛ) проводили методом КЦФ [3], путем регистрации уровня внутрилимфоцитарных иммуноглобулинов. Определение СИАЛ проводили также, как и СПАЛ, только вместоакридин оранжевого использовали люминесцирующию сыворотку против иммуноглобулинов человека (ФИТЦ-сыворотка). После этого уровень внутриклеточных иммуноглобулинов определяли с помощью метода КЦФ по интенсивности флюоресценции (Ф). Сравнивая уровни внутрилимфоцитарных иммуноглобулинов в опыте и контроле, выводили показатель СИАЛ=(Ф опыт : Ф контроль)х 100 усл.ед.

За положительный результат принимали значение СИАЛ, превышающее максимальное значение доверительного интервала у здоровых лиц, по формуле М±σ (где σ – среднее квадратичное отклонение), т.е. значение СИАЛ равное 135 усл.ед. и более.

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью пакета статистических программ с выделением критерия t-Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Уровни СПАЛ в обследованных группах представлены в таблице 1.

Таблица 1

Уровень СПАЛ в обследованных группах

Примечание: 1. в скобках доверительный интервал у здоровых лиц по формуле М±σ.

2.*- достоверно, по сравнению со здоровыми лицами (*- p<0,05; **-p<0,01;

***- р<0,001).

3. p₁ – разница междуАС и ОА; p₂ – АС и РеА; p₃ – АС и РА; p₄ – АС и СКВ;

Как видно из таблицы 1, показатель СПАЛ у больных АС был выше, чем у здоровых лиц и больных ОА, но меньше чем у больных РА и СКВ.

Из приведенных данных таблицы 1 видно, что уровень СПАЛ у больных АС был достоверно выше, чем у здоровых лиц (р<0,001). У больных РеА из группы сравнения данный показатель также достоверно превышал нормативный показатель (р<0,01). А у больных ОА из группы сравнения вышеуказанный показатель практически не отличался (p>0,05) от здоровых лиц. У больных РА и СКВ вышеуказанный показатель был достоверно больше, чем у здоровых лиц (р<0,001). Особо следует отметить то, что показатель СПАЛ у больных АС был достоверно (р₁<0,001) выше, чем у больных ОА, и недостоверно в виде тенденции (р₂>0,05), чем у больных РеА. В то же время этот показатель у больных АС был достоверно ниже, чем у больных РА (р₃<0,05) и СКВ (р₄<0,001)

Частота положительных результатов распределилась следующим образом: уровень СПАЛ выше нормы выявлен у 72,2% больных АС, у 36,4% больных ОА, у 57,9% больных РеА, у 82,1%больных РА, у 88,8% больных СКВ и у всего лишь 6,7% здоровых лиц.

Уровни СИАЛ в обследованных группах представлены в таблице 2.

Таблица 2

Уровень СИАЛ в обследованных группах

Примечание: 1. в скобках доверительный интервал у здоровых лиц по формуле М±σ. 2.*- достоверно, по сравнению со здоровыми лицами (*- p<0,05; **-p<0,01; ***- р<0,001). p₁ – разница между АС и ОА; p₂ – АС и РеА; p₃ – АС и РА; p₄ – АС и СКВ;

Как видно из таблицы 2, показатель СИАЛ у больных АС значительно выше, чем у представителей контрольной группы и больных ОА, но меньше чем у больных СКВ и РА. При этом минимальное значение данного показателя найдено у лиц контрольной группы, среднее значение СИАЛ выявлено у больных АС и РеА, максимальное же значение вышеуказанного показателя наблюдается у больных РА и СКВ.

Уровень СИАЛ у больных АС был достоверно выше, чем у здоровых лиц (р<0,001) и больных ОА (р<0,001). Показатель СИАЛ при АС был недостоверно (р>0,05) больше, чем при РеА. Значение СИАЛ у больных АС был достоверно ниже, чем у больных РА (p<0,05) и СКВ (р<0,001).

В частоте вышеуказанного показателя, выходящего за границы доверительного интервала нормы, имеется следующее различие: уровень СПАЛ выше нормы обнаружен у 94,4% больных СКВ, у 84,3% больных РА, у 77,8% больных АС, у 52,6% больных РеА, лишь у 27,3% больных ОА и всего лишь у 13,3% здоровых лиц.

Высокая пролиферативная и иммуноглобулинситезирующая активность B-лимфоцитов на фоне дефицита супрессорной функции Т-лимфоцитов свойственна аутоиммунным воспалительным заболеваниям, в частности РА, СКВ, АС [8,9,10]. Обнаруженный нами высокий уровень СПАЛ и СИАЛ у больных АС, лишний раз доказывает наличие высокой степени гиперактивности иммунного ответа при этом заболевании. Наличие В-лимфоцитов с высокой спонтанной пролиферативной и иммуноглобулинсинтезирующей активностью, по-видимому, лежит в основе продукции последними антител с формированием иммунных комплексов, вызывающих иммунное воспаление межпозвоночных суставов с развитием клинических, лабораторных и инструментальных признаков АС. Выявленное нами более повышенное значение СПАЛ и СИАЛ у больных АС, по сравнению с больными ОА и РеА, еще раз доказывает более высокую активность В-лимфоцитов и других иммунных нарушений приАС, чем при ОА и РеА. В то же время гораздо высокие параметры СПАЛ и СИАЛ при РА и особенно СКВ, по сравнению сАС, показывают максимальную выраженность при этих заболеваниях аутоиммунных сдвигов, в последующем определяющих гипервыраженность клинико-лабораторных проявлений РА и СКВ.

Вышеприведенные данные, а именно высокие уровни СПАЛ и СИАЛ у больных АС по сравнению со здоровыми и больными, меньшие уровни РеА и ОА здоровых по сравнению с больными, чем при РА и СКВ, согласуясь с работами других авторов, подтверждают соответствие выраженности иммунных нарушений наличию и степени воспалительного процесса при АС.

Заключение: Таким образом, уровни СПАЛ и СИАЛ приАС были достоверно выше, чем у здоровых лиц и больных ОА, и были меньше, чем у больных РА и СКВ. Определение СПАЛ и СИАЛ может быть использовано для уточнения активности и степени тяжести болезни, а также в качестве показания для назначения иммунодепрессивной терапии.

Литература:

1. Насонов Е.Л. Ревматология. Клинические рекомендации, 2-е издание.-М, «Геотар-Медиа». 2010; 271-297.

2. Zhang G., Luo J., Bruckel J. et all. Genetic studies in familial ankylosing spondylitis susceptibility. Artritis Rheum.2004; 50: 2246-2254.

3. Бененсон Е.В., Цай Е.Г. Авторское свидетельство СССР №1328757//Открытия. – 1987. - №48

4. Тимофеев В.Т., Шостак Н.А., Логинова Т.К., Мурадянц А.А., Салмаси Ж.М., Потанин А.Ю. Иммунодиагностика раннего РА // Научно-практическая ревматология. М., 2003.-№2.–с.75 (приложение №287).

5. Порядин Г.В., Семёнова Л.Ю., Казимирский А.Н., Просвиров Е.Ю., Кельцева М.В. Характеристика субпопуляций лимфоцитов и активационных процессов в иммунной системе больных ранним ревматоидным артритом // Научно-практическая ревматология. – М., 2002.-№4.–с.22-25.

6. Мамасаидов А.Т., Мурзабаева Г.О., Кулчинова Г.А. Клиническое значение показателя спонтанной пролиферативной активности B-лимфоцитов при воспалительных ревматических заболеваниях. // Научно-практическая ревматология. М., 2003.-№2.–с.66.

7. Мамасаидов А.Т., Мамасаидова Г.М., Сакибаев К.Ш., и соавторы Спонтанная пролиферативная активность В-лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и неспецифическом язвенном колите // Медицинская иммунология. – 2006. – том 6. №4. – с.557–560 .

8. Cohen S.B. Targeting the B cell in rheumatoid arthritis. Best Prac Res ClinRheumatol 2010;24:553–63.

9. Moller B., Aeberli D., Eggli S. et. al. Class-switched B cells display response to therapeutic B-cell depletion in rheumatoid arthritis. Arthr Res Ther 2009;11:62.

10. Roll P., Palanichamy A., Kneitz C. et al Regeneration of B cell subsets after transient B cell depletion using anti-CD20 antibodies in rheumatoid arthritis. ArthrRheum 2006;54:2377–86.