Новый клеточный тромбоцитарный регенеративный метод терапии алопеций



Ключевые слова: тромбоцитарная терапия, PRP, плазмотерапия.

Мы всегда стараемся найти наилучшие способы терапии волос, оптимизировать подходы к терапии, и определить методы, которые превосходят существующие методики. В 2018 году наши коллеги из отделения лаборатории Экспериментального тромбоза и отделения экспериментальной патологии института Национальной Академии, Департамента биотехнологий Школы фармакологии и биохимии провели масштабное исследование, в котором показали и открыли, что Плазма вмешивается в проангиогенную роль тромбоцитов, т. е. подавляет их функции. Плазма подавляет ангиогенез (рост новых сосудов), опосредованный тромбоцитами. Для этого они сравнили образование новых сосудов при воздействии чистыми Тромбоцитами, выделенными из крови и тромбоцитами в плазме в сходной концентрации. И оказалось с высоким уровнем доказательности (Р<0,01, т. е. «различия обнаружены на высоком уровне статистической значимости»), что образование сосудов в группе при воздействии чистыми тромбоцитами было значительно выше, чем в группе, получавших плазму с тромбоцитами. Кроме того, когда в группу получавших тромбоциты добавляли плазму, образование сосудистых клеток уменьшалось пропорционально количеству плазмы. [1]

Кроме того, нашими коллегами из Токио было показано, что пробирки с EDTA дают наибольшую концентрацию тромбоцитов. [2]

Известны методики получения плазмы с различной концентацией тромбоцитов. Богатой тромбоцитами плазма считается, когда количество тромбоцитов после центрифугирования превышает концентрацию тромбоцитов в нативной крови. [4, 5]. В случае, когда количество тромбоцитов меньше, чем в нативной крови методика называется Плазмой, обедненной тромбоцитами (PPP — Platelet Pure Plasma). Методика, в которой концентрация тромбоцитов приближается к нулевой называется Обедненной тромбоцитами плазмой. [6,7] Истинная PRP по Marx R. E. содержит концентрацию тромбоцитов более 1000 в мл или более 1000000в мкл [4,5]

Нам потребовалось немного времени, чтобы оптимизировать способ получения чистых тромбоцитов из крови пациентов, с максимальной концентрацией более 1000 в мл, а в некоторых случаях мы получали концентрацию более 1500 тромбоцитов в мл. И с 2018 года в клинической практике Мы с успехом используем Регенеративную Клеточную Тромбоцитарную Терапию в трихологии, результативность которой подтверждена статистически.

Для исследования мы взяли кровь у 10 пациентов и определили количество тромбоцитов в цельной крови, после центрифугирования в пробирке с EDTA, после центрифугирования в пробирке ACD-A, и после центрифугирования в предложенной автором методике. Пробирки были разделены на группы, первая группа — нативное содержание тромбоцитов в крови у пациентов, вторая группа — содержание тромбоцитов после центрифугирования в пробирке с EDTA, третья группа — содержание тромбоцитов в пробирке с ACD-A, четвертая группа — содержание тромбоцитов в пробирке по предложенной автором методике. Исследование уровня тромбоцитов в крови проводилось при комнатной температуре на гематологическом анализаторе Sysmex. Далее мы провели статистический анализ концентрации тромбоцитов в пробирках и по нашей методике.

Результаты собственных исследований

Содержание тромбоцитов в цельной крови у пациентов в первой группе составило (таблица 1):

Таблица 1

Содержание тромбоцитов вцельной крови упациентов

Пациенты	Количество тромбоцитов вмл
Пациент 1	226
Пациент 2	217
Пациент 3	274
Пациент 4	239
Пациент 5	176
Пациент 6	210
Пациент 7	178
Пациент 8	201
Пациент 9	204
Пациент 10	184

Результаты были статистически обработаны по критерию Колмогорова-Смирнова. Результаты показали, что значение статистического теста K-S (D) составляет 0,1903. Значение p = 0,99534. Данные существенно не отличаются от тех, которые обычно распространяются.

При статистическом анализе по Шапиро-Вилк (Shapiro-Wilk) определяется, что данные распределены нормально. (рис 1)

Среднее арифметическое (а=211), Дисперсия 882.88889, Среднеквадратическое отклонение 29.71345, Коэффициент вариации 14.08 %

Рис. 1. Нормальное распределение тромбоцитов в крови пациентов в нативной плазме

Число единиц наблюдения (n): 10. Средняя арифметическая (М): 211.20Медиана (Ме): 207Стандартное квадратичное отклонение (σ): 29.91Коэффициент вариации (Cv): 14.16 %Средняя ошибка средней арифметической (m): 9.97

При центрифугировании крови в пробирки с ACD-A мы получили следующие показатели (таблица 2):

Таблица 2

Содержание тромбоцитов вкрови пациентов после центрифугирования крови впробирках сACD-A.

Пациенты	Количество тромбоцитов вмл
Пациент 1	393
Пациент 2	536
Пациент 3	471
Пациент 4	302
Пациент 5	391
Пациент 6	461
Пациент 7	390
Пациент 8	392
Пациент 9	307
Пациент 10	330

Результат: значение статистического теста K-S (D) составляет 0,22409.

При статистическом анализе значение p=0,62042. Данные существенно не отличаются от тех, которые распространяются.

Поскольку p> α по статистическим показателям по Шапиро-Вилк (Shapiro-Wilk) определяется, что данные распределены нормально. (рис 2)

Рис. 2. Нормальное распределение показателей тромбоцитов после центрифугирования в пробирке с ACD-A

Среднее арифметическое 393,3 Дисперсия 5625.78889 Среднеквадратическое отклонение 75.00526 Коэффициент вариации 18.88 %

Число единиц наблюдения (n): 10Средняя арифметическая (М): 397.30Медиана (Ме): 391.5Стандартное квадратичное отклонение (σ): 75.01Коэффициент вариации (Cv): 18.88 %Средняя ошибка средней арифметической (m): 25.00

При центрифугировании крови в пробирки с EDTA мы получили следующее содержание тромбоцитов (таблица 3):

Таблица 3

Содержание тромбоцитов вкрови пациентов после центрифугирования крови впробирках сEDTA.

Пациенты	Количество тромбоцитов вмл
Пациент 1	626
Пациент 2	782
Пациент 3	750
Пациент 4	664
Пациент 5	642
Пациент 6	714
Пациент 7	601
Пациент 8	599
Пациент 9	691
Пациент 10	705

Значение статистического теста K-S (D) составляет 0,12648.

Значение p= 0,99064. данные существенно не отличаются в выборке.

Поскольку p>α по статистическим показателям по Шапиро-Вилк (Shapiro-Wilk) определяется, что данные распределены нормально (Рис 3)

Рис. 3. Нормальное распределение данных тромбоцитов у пациентов в крови после центрифугирования в пробирке с EDTA

Среднее арифметическое составило 677,4

Дисперсия 3839.6, Среднеквадратическое отклонение 61.96451

Число единиц наблюдения (n): 10Средняя арифметическая (М): 677.40Медиана (Ме): 677.5Стандартное квадратичное отклонение (σ): 61.96Коэффициент вариации (Cv): 9.15 %Средняя ошибка средней арифметической (m): 20.65

При центрифугировании по предложенному нами способу мы получили концентрацию тромбоцитов представленной в таблице 4

Таблица 4

Содержание тромбоцитов по предложенному нами способу

Пациенты	Количество тромбоцитов вмл
Пациент 1	1682
Пациент 2	1420
Пациент 3	1814
Пациент 4	1573
Пациент 5	1332
Пациент 6	1570
Пациент 7	1346
Пациент 8	1507
Пациент 9	1528
Пациент 10	1609

Значение статистики теста K-S (D) составляет 0,1364.

Значение p=0,99741. Данные существенно не отличаются от тех, которые обычно распространяются.

Поскольку p>α по статистическим показателям по Шапиро-Вилк (Shapiro-Wilk) определяется, что данные распределены нормально (рис 4)

Рис. 4. Нормальное распределение тромбоцитов по предложенной нами методике

Среднее арифметическое 1538,1, дисперсия 22054,1, среднеквадратичное отклонение 148,50623 Коэффициент вариации 9,66 %

Число единиц наблюдения (n): 10Средняя арифметическая (М): 1538.10Медиана (Ме): 1549Стандартное квадратичное отклонение (σ): 148.51Коэффициент вариации (Cv): 9.66 %Средняя ошибка средней арифметической (m): 49.50

При статистическом сравнении по Шапиро-Вилк распределения тромбоцитов в пробирках с EDTA, ACD-A и по нашей методике мы получили p-значение <α, Предполагается, что данные не распределяются нормально. (рис 5)

Рис. 5. Ненормальное распределение тромбоцитов в пробирках с ACD-A, EDTA и по нашей методике после центрифугирования

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в нативной плазме и в пробирках с ACD-A

U-критерий Манна-Уитни равен 0. Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 230 ≤ 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05).Значение t-критерия Стьюдента: 6.91,Различия статистически значимы (p=0.000003).Число степеней свободы f = 18,Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости α = 0,05

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в нативной плазме и в пробирках с EDTA

U-критерий Манна-Уитни равен 10Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 2310 ≤ 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05). Значение t-критерия Стьюдента: 20.33, Различия статистически значимы (p=0.000000). Число степеней свободы f = 18, Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости α = 0,05

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в нативной плазме и в пробирках по нашей методике

U-критерий Манна-Уитни равен 0. Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 230 ≤ 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05).Значение t-критерия Стьюдента: 26.28.Различия статистически значимы (p=0.000000).Число степеней свободы f = 18.Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости α = 0,05

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в пробирке с ACD-A и в пробирках с EDTAНачало формы

U-критерий Манна-Уитни равен 0.Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 230 ≤ 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05).Значение t-критерия Стьюдента: 8.64.Различия статистически значимы (p=0.000000).Число степеней свободы f = 18.Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости α = 0,05

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в пробирке с ACD-A, пробирках с EDTA и по нашей методике

U-критерий Манна-Уитни равен 0. Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 550 ≤ 55, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05)

В пробирках с ACD и EDTA Число единиц наблюдения (n): 20Средняя арифметическая (М): 537.35Медиана (Ме): 567.5Стандартное квадратичное отклонение (σ): 158.52Коэффициент вариации (Cv): 29.50 %.Средняя ошибка средней арифметической (m): 36.37.Значение t-критерия Стьюдента: 16.29.Различия статистически значимы (p=0.000000).Число степеней свободы f = 28.Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.048, при уровне значимости α = 0,05

Выводы:

На основании полученных результатов, мы можем утверждать, что:

1. Пробирки с EDTA дают наибольшую концентрацию тромбоцитов в сравнении с пробирками с ACD-A по отношению к нативной крови. Но концентрация тромбоцитов недостаточная, чтобы считать данную методику PRP-терапией.
2. По нашей методике концентрация тромбоцитов превосходит концентрацию тромбоцитов в пробирках с EDTA и в пробирках с ACD-A, превышает концентрацию тромбоцитов более 1000 в мл и считается PRP-терапией.

Нами разработана уникальная методика обогащения концентрата тромбоцитами, причем полученная взвесь тромбоцитов содержит минимальное количество лейкоцитов и эритроцитов, а содержание тромбоцитов варьируется от 1500 до 2000 в мл, позволяющая добиться оптимального результата для стимуляции роста волос. Результаты клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии по методу доктора Клюкина М. Г. представлены на рис 6–8.

Рис. 6. До и после клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии

Рис. 7. До и после клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии

Рис. 8. До и после клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии.

Литература:

1. Etulain, J., Mena, H.A., Meiss, R.P. et al. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Sci Rep 8, 1513 (2018)
2. Jun Araki, M.D., Masahiro Jona, M.T., [...], and Kotaro Yoshimura, M. D. Optimized Preparation Method of Platelet-Concentrated Plasma and Noncoagulating Platelet-Derived Factor Concentrates: Maximization of Platelet Concentration and Removal of Fibrinogen Tissue Eng Part C Methods. 2012 Mar; 18(3): 176–185.
3. J. Stevens, BS and S. Khetarpal, MD Platelet-rich plasma for androgenetic alopecia: A review of the literature and proposed treatment protocol Int J Womens Dermatol. 2019 Feb; 5(1): 46–51.
4. Marx R. E. Platelet-rich plasma (PRP): What is PRP and what is not PRP. Implant Dent. 2001;10(4):225–228
5. Rachul C, Rasko JEJ, Caulfield T. Implicit hype. Representations of platelet rich plasma in the news media. PLoS ONE. 2017;12: e0182496.
6. Рагимов Г. А., Олисова О. Ю., Егорова К. Г. Неактивированная тромбоцитарно-лейкоцитарная аутоплазма в лечении нерубцовых алопеций. Российский журнал кожных и венерических болезней 2016; 19(6): 369–377. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560–9588–2016–19–6–369–377
7. Ахмеров Р. Р., Зарудий Р. Ф., Бочкова О. И. (Короткова), Рычкова И. Н. Аутостимуляция дермы при повышенном выпадении волос и алопеции // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. — 2011. — № 4. — С. 36–40
8. Marco Cattaneo, Anna Lecchi, Maddalena Loredana Zighetti, Federico Lussana. «Platelet aggregation studies: autologous platelet-poor plasma inhibits platelet aggregation when added to platelet-rich plasma to normalize platelet count». Haematologica, 2007, 92(05)