Влияние отваров листьев белого (Morus alba) и черного (Morus nigra) тутовника на функциональную активность лейкоцитов крови экспериментальных животных и человека и in vitro

Растения составляют основную биологическую массу нашей планеты. Они обеспечивают круговорот веществ в природе, поддерживают естественный баланс углекислого газа. Флора Земли насчитывает 12000 видов только целебных растений. Из них 2850 произрастают в Туркменистане [1,2,7,11].

Лечебные свойства растений Средней Азии с давних времен привлекают внимание врачей и естествоиспытателей. Народная медицина накопила обширные знания по использованию лекарственных растений и передает их из поколения в поколение. Часть этих знаний дошла до наших дней, и используется фармакологами, ботаниками и физиологами.

Разнообразный видовой состав флоры Туркменистана открывает широкие перспективы использования препаратов из лекарственных растений в качестве средств профилактики и лечения различных заболеваний. Из 2850 видов флоры Туркменистана лекарственное значение имеют около 350 видов. В народной медицине Туркменистана наиболее популярны следующие лекарственные растения: солодка голая (Glycyrhiza glabra), верблюжья колючка (Alhagi persarum), гармала (Peganum harmala L.), парнолистник (Zygophyllum fabago L.), ферул (Ferula assa-foetida L.), можжевельник (Juniperus turcomanica), листья и плоды белого (Morus alba L.) и черного тутовника (Morus nigra L.) и многие другие [3,11]. Все эти растения имеют широкий спектр биологической активности и способны оказывать разностороннее действие на организм человека и животных. . Химический состав листьев различных сортов тутовника изучается учеными Туркменитстана еще с 50 -х – 60-х годов. Исследованиями О.Мамедниязова, Н.Соловьева, П.Кулиева и других (1958, 1961) (цит. по 11) была изучена концентрация фосфора, азота, углеводов в листьях различных сортов тутовников. В настоящее время установлено, что в листьях белого тутовника содержатся органические кислоты (0,74%), витамин С (56,3мг%), сахаристые вещества, аминокислоты, флавоноиды. В листьях черного тутовника выявлен помимо всего гликозид тутин.

В народной медицине настои и отвары листьев белого тутовника применяют при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, при малокровии, скарлатине, крапивнице. Отвар широко назначается и как жаропонижающее, гипотензивное, гипогликемическое средство. Листья черного тутовника используются еще как ранозаживляющее средство [1,2,7]. В китайской народной медицине водный настой коры корней используют при гипертонии, бронхитах и бронхиальной астме. Отвар коры ствола употребляют при сердечных заболеваниях, а настой листьев — как жаропонижающее при лихорадочных заболеваниях [10,16]. В литературе нам не удалось найти сведений о механизме характере влияния отваров листьев тутовника на иммунную систему человека и животных.

Целью настоящего исследования являлось изучение влиния 5% отваров листьев белого (Morus alba) и черного (Morus nigra) тутовника (ОЛБТ, ОЛЧТ) на функциональную активность лейкоцитов периферической крови (НПК) практически здоровых лиц.

Материалы и методы исследования.

При выполнении настоящей работы была использована периферическая кровь 70 практически здоровых женщин (ПЗЖ) – работниц ковровой фабрики №1 (г.Ашхабад) и 30 белых нелинейных мышей самцов массой не менее 20г.

Для приготовления отваров листья тутовника собирали с апреля по май (в период активной вегетации) в экологически чистой местности. Собранные листья промывали в проточной воде, высушивали в тени в марлевых мешках. Хранили в стерильных бумажных пакетах в сухом прохладном помещении. Из сухих листьев в соответствии с правилами Фармакопеи готовили 5% отвары на водяной бане в течение 45 минут [15,19]. Отвары листьев белого и черного тутовника (ОЛБТ, ОЛЧТ) процеживали, доводили объем дистиллированной водой, давали остыть, затем использовали по назначению. Приготовленные отвары хранили не более, чем в течение 2-3- суток в холодильнике при +4°С.

Реакцию спонтанного и индуцированного фитопрепаратами розеткообразования ставили академическим способом [5,6]. Результаты выражали в % розеткообразующих клеток (РОК). Реакцию модуляции миграции лейкоцитов ставили по С.А. Плескановской, 1982 [14]. Методика представляет собой авторскую модификацию реакции торможения миграции лейкоцитов. Результаты выражали в виде индекса модуляции миграции лейкоцитов (ИММЛ).

Математическую обработку всего цифрового материала проводили при помощи прикладной компьютерной программы SPSS. Определяли среднюю арифметическую ряда (с 95% довери­тель­ным интервалом), медиану, стандартное отклонение средней арифме­ти­ческой, достоверность различия между группами, кластерный анализ полученных данных.

Результаты исследования. Одной из важнейших характеристик иммуномодуляторов является их способность влиять на спонтанное и индуцированное розеткообразование, а так же миграцию лейкоцитов из стеклянного капилляра [4,12,13].

Известно, что лимфоциты крови млекопитающих представлены большим числом разновидностей (популяций и субпопуляций). Каждая разновидность лимфоцитов осуществляет определенные функции. По внешнему виду лимфоциты не отличаются друг от друга даже под электронным микроскопом. Их различают по функциональной активности. Одной из общепринятых характеристик функциональной активности лимфоци­тов, а также их идентификации является их способность формировать так называемые “розетки” с эритроцитами или другими корпус­кулярными частицами. Доказано, что лимфоциты млеко­пи­та­ющих обладают способностью присоединять к себе эритроциты, частицы латекса или зимозана. При этом лимфоцит всегда находится в середине, а частицы распределяются по его поверхности. Получаемая при этом фигура и называется “розетка”. У человека Т-лимфоциты образуют “розетки” с эритроцитами барана (ЭБ), В-лимфоциты - с частицами латекса, зимозана, эритроцитами мыши [9,16,18]. Среди экспериментальных животных только лимфоциты морских свинок способны формировать спонтанные «розетки» с эритроцитами кролика [18]. Лимфоциты мышей, крыс и кроликов спонтанных «розеток» не формируют.

Таким образом, формирование «розеток» является не только характеристикой функциональной активности лимфоцитов крови млекопитающих, но и видовыми маркерами лимфоцитов. В настоящей работе мы изучали влияние ОЛТ на розеткообразующую активность лимфоцитов человека. В качестве маркера Т-лимфоцитов использовали эритроциты барана, В-лимфоцитов – эритроциты мыши.

Было установлено, что у здоровых лиц молодого возраста розетко­образующей способностью обладают от 49 до 58% Т-лимфоцитов и от 18 до 21% В-лимфоцитов, что в среднем составило 57,5+6,7 % и 19,5+1,8 % соответственно (рис.1).

При добавлении в среду культивирования лимфоцитов ОЛТ мы наблюдали значительные модуляции розеткообразующей активности лимфоцитов. В частности, число Т- лимфоцитов в среднем увеличилось на 5%, число В-лимфоцитов снизилось в среднем на 4% (рис.2).

Однако, лимфоциты здоровых лиц реагировали на присутствие в среде культивирования ОЛТ различной реакцией или не реагировали вообще. Результаты кластерного анализа реакции Т- и В-лимфоцитов на присутствие ОЛТ представлен на диаграммах 3 и 4, на которых видно, что активация розеткообразования Т-лимфоцитов в присутствии ОЛТ наблюдается у 60%, не изменяется у 28% и угнетается у 12% здоровых лиц. ОЛТ угнетает розеткообразующую активность В-лимфоцитов у 48%, не изменяет у 36% и повышает у 16% здоровых лиц.

Феномен розеткообразования опосредуется рецепторами цитоплаз­мати­ческих мембран лимфоцитов. Следовательно, существует индивидуальная чув­ст­вительность мембранных рецепторов лимфоцитов к ОЛТ.

Одной из важнейших характеристик функциональной активности лейкоцитов крови млекопитающих является их способность к миграции как in vivo так и in vitro. Мы изучили влияние препаратов на миграционную активность лейкоцитов белых нелинейных мышей и человека in vitro.

Было выделено две группы животных, по 15 голов в каждой. Из хвостовой вены мышей в гепаринизированный капилляр набирали кровь и ставили реакцию торможения миграции [14]. Результаты исследования показали, что в целом по группе обследованных животных отвары листьев белого (ОЛБТ) и черного тутовника (ОЛЧТ) тормозят миграцию лейкоцитов из капилляра.

Если число лейкоцитов, мигрировавших в камеру с физиологическим раствором хлорида натрия, принять за 100%, то в присутствии как ОЛБТ, так и ОЛЧТ в целом по группам оно составило 79,9+2,3% и 83,3+1,7% соответственно (рис.5). Различие между группами не достоверно (p>0,05). Однако, кластерный анализ данных показал, что не во всех случаях лейкоциты мышей отвечают торможением миграции на присутствие отваров листьев белого и черного тутовника. В 28 % случаев лейкоциты крови мышей практически не реагировали на присутствие ОЛБТ и 35% на ОЛЧТ в инкубационной среде. ИМЛ в этих группах составил 97,3+2,9% и 98,2+1,9% соответственно (р>0.05).

В подавляющем большинстве случаев препараты подавляли миграцию лейкоцитов (ИМЛ<100). Причем, ОЛБТ - у 61,5% ОЛЧТ – у 46% мышей (рис.6). ИМЛ в этих подгруппах был ниже, чем в среднем по всей группе и составил 63,2+3,7% и 67,8+3,1 соответственно. Различие статистически достоверно по отношению к средней величине ИМЛ по всей группе животных (р<0,05).

У 11 % мышей в присутствии ОЛБТ и 19% - в присутствии ОЛЧТ значения ИМЛ были значительно выше среднего значения по группе – и в среднем составил 135,8+12,1% и 149,6+11,9% соответственно (рис.7).

Таким образом, отвар листьев тутовника in vitro проявляет способность, как тормозить, так и стимулировать миграционную активность лейкоцитов крови белых нелинейных мышей, то есть оказывать как противовоспалительный, так и провоспалительный эффект.

О характере влияния отвара листьев тутовника (ОЛБТ) на лейкоциты периферической крови практически здоровых лиц в возрасте от 20 до 27 лет судили так же по величине индекса миграции лейкоцитов (ИМЛ). Исследования показали, что в целом по группе обследованных лиц ОЛБТ тормозит миграцию лейкоцитов.

Однако лейкоциты 24% практически здоровых лиц не реагировали in vitro на присутствие препарата в инкубационной среде. ИМЛ в этой группе составил 98,3+1,9%. В 60% случаев препарат угнетал миграционную активность лейкоцитов. ИМЛ в этой группе был ниже, чем в среднем по всей группе обследованных лиц и составил 53,5+2,4%. У 32% из них ИМЛ был очень низким и составил 34,7+2,1%. Различие статистически достоверно по отношению ко всей группе (р<0,05).

У 16% обследованных лиц ИМЛ был значительно выше среднего значения по группе и составил 159,8+11,7% (рис.8).

Следовательно, как у экспериментальных животных (белых мышей), так и здорового человека отвар листьев тутовника в подавляющем большинстве случаев (не менее 60%) in vitro тормозит миграцию лейкоцитов (проявляет противовоспалительный) и значительно реже (16% случаев) стимулирует ее (то есть проявляет противовоспалительный эффект), поскольку известно, что первыми в очаг воспаления мигрируют нейтрофилы крови [16,18].

Таким образом, отвар листьев тутовника влияет на розеткообразующую и миграционную активность лимфоцитов крови млекопитающих, что, на наш взгляд позволяет говорить о его достаточно выраженных иммуномодулирующих свойствах.

Литература:

1. Бердымухамедов Г.М. Лекарственные растения Туркменистана, том 1. Ашхабад, Туркменистан 2008, 320 с.

2. Бердымухамедов Г.М. Лекарственные растения Туркменистана, том 11. Ашхабад, Туркменистан 2009, 280 с.

3. Гаммаерман А.Ф., Кадаев Г.Н. Лекарственные растения. М: Москва, 1990. 427 с.

4. Иммунодефицитные состояния (под ред. В.С. Смирнова, И.С.Фрейдлин) СПб, 2000, 278 с.

5. Иммунодиагностика и иммунокоррекция (под ред. И.Д.Столярова). СОТИС, СПб, 1999. 170 с.

6. Иммунологические методы исследования (под ред Г.Фримеля). М: Медицина. 1987, 299 с.

7. Каррыев М.О. Медицинские растения Туркменистана. Ылым: Ашхабад. 1996, 212 с.

8. Каррыев М.О., Артемьева М.В. и др. Фармакохимия лекарственных растений Туркменистана (под ред. проф. Прокопенко А.П.). Ылым:Ашхабад.1991 203с.

9. Клиническая лабораторная диагностика, 2001. №8, стр.36-38.

10. Муравьева Д.А. Тропические и субтропические лекарственные растения. М: Медицина, 1983, 335 с.

11. Никитин В.В., А.Н. Гельдыханов Определитель растений Туркменистана, Л: Наука, 1988. 345 с.

12. Основы клинической иммунологии (перевод с англ.) ГОЭТАР-Медиа. 2008, 416 с.

13. Петров Р.В., Манько В.М. Иммунодепрессоры (справочник). М: Медицина, 1971, 300 с.

14. Плескановская С.А. Клеточный и гуморальный иммунный ответ при кожном лейшманиозе.

15. Фармакопея СССР, изд.11, вып.2. М: Медицина, 1990, 398 с.

16. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М: Медицина, 2000, 245 с.

17. Шигина Ю.В. Иммунология М-РИОР, 2007, 163 с.

18. Яковлева Л.В., Герасимова О.А. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2001, т. 64, №2, стр.55-59.

Рис. 1. Розеткообразующие лимфоциты крови здоровых лиц (спонтанное розеткообразование)

Рис.2. Розеткообразующая активность лимфоцитов крови здоровых лиц в присутствии ОЛТ

Рис.3. Структура величины ИМЛ в присутствии ОЛТ у практически здоровых лиц

Рис.4-5. Модуляции розеткообразующей активности Т- и В-лимфоцитов крови человека в присутствии ОЛТ

Рис.6. Миграционная активность лейкоцитов крови мышей in vitro в присутствии отвара листьев белого (ОЛБТ) и черного (ОЛЧТ) тутовника

Рис.7. Структура значений ИМЛ у мышей в зависимости от препарата