Статья посвящена изучению вопроса методов преимплантационной генетической диагностики в программах ВРТ
Ключевые слова: преимплантационная генетическая диагностика (ПГД), вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), генетические нарушения, эмбрион.
Актуальность. Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — современная методика, использующаяся в программах вспомогательных репродуктивных технологий, позволяет выявить наличие генетических нарушений у эмбрионов до переноса в полость матки.
Значительная часть визуально (внешне) нормальных эмбрионов в программах ВРТ могут быть генетически аномальными. Перенос таких эмбрионов в полость матки может повлечь за собой отсутствие имплантации (беременности), неразвивающуюся беременность либо тяжелые нарушения у будущего ребенка. [2]
Цель исследования: рассмотреть различные методы преимплантационной генетической диагностики в программах ВРТ, их возможности и ограничения.
Кому рекомендована ПГД? В последнее время рекомендуется проведение ПГД эмбриона во всех случаях использования вспомогательных репродуктивных технологий. [1] Выбор метода ПГД супружеская пара осуществляет совместно с лечащим врачом на основании тщательно собранного анамнеза.
В настоящее время актуальными методами ПГД являются:
- FISH — метод флуоресцентной гибридизации in situ (от англ. fluorescent in situ hybridization);
- aCGH (от англ. comparative genomic hybridization);
- NGS — секвенирование нового поколения (от англ. next generation sequencing);
- realTime PCR — ПЦР (Полимеразная цепная реакция) в реальном времени.
FISH (fluorescence in situ hybridization). Метод основан на связывании ДНК-зонда, меченного флюоресцентным красителем, с ДНК хромосомы исследуемого образца.
Возможности:
— проведение скрининга преимплантационных эмбрионов по наиболее частым анеуплоидиям хромосом 8,9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y;
— определение генетического пола эмбрионов;
— проведение ПГД эмбрионов у носителей хромосомных перестроек.
Ограничения:
— метод не включает в себя определение 24 типов хромосом;
— колоссальная зависимость от качества фиксации;
— не позволяет исключить мозаицизм;
— диагностика проводится на конкретную патологию, и не позволяет исключить аномалию в не исследуемых участках;
— нельзя выявить однородительскую дисомию;
— невозможно совмещать с другими видами ПГД (на моногенные заболевания, HLA).
aCGH (comparative genomic hybridization). Конкурентная гибридизация in situ двух геномных ДНК библиотек, одной — полученной из анализируемой ткани/единичных клеток, второй — контрольной (из лимфоцитов периферической крови здорового индивида), взятых в равном соотношении и меченых разными флуорохромами на мембрану/микрочип, на котором расположены тысячи локус-специфических ДНК-фрагментов здорового человека.
Возможности:
— выявление численных аномалий хромосом (анеуплоидии), включая мозаичные варианты;
— детекция структурных аберраций хромосом;
— микроделеции/микродупликации;
— несбалансированные субтеломерные перестройки;
— маркерные хромосомы;
— возможность определения дисомий.
Ограничения:
— результаты исследования не исключают наличия сбалансированных перестроек: реципрокных транслокаций, инверсий, робертсоновских транслокаций;
— несбалансированных перестроек за границей разрешения: делеций и дупликаций ниже границы чувствительности, точечных мутаций;
— ограниченная возможность детекции полиплоидии и мозаицизма (от 30 %);
— результативность метода зависит от качества исходного материала.
NGS (Nеxt Generation Sequensing). Секвенирование нового поколения — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания ее структуры. Метод предоставляет исчерпывающую информацию о ДНК эмбриона в отношении заболеваний или генетических дефектов.
Возможности:
— возможность тестирования всех 24 хромосом одновременно с беспрецедентной точностью;
— увеличение точности для диагностики мозаичных анеуплоидий;
— можно выявить однородительскую дисомию (при анализе образцов родителей);
— можно определить гаплоидов и триплоидов;
— возможность выявления микро- и макроперестроек (от 10 п.н.);
— возможность одновременной диагностики моногенных заболеваний;
— в ПГД NGS для каждого образца назначен дополнительный молекулярный код, исключая возможность ошибки;
— низкая себестоимость расходных материалов.
Ограничения:
— нельзя определить тетраплоидов;
— высокая стоимость оборудования.
Re alTime PCR. В данном методе используются общие принципы ПЦР, которые заключаются в удвоении участка ДНК, ограниченного праймерами, при помощи фермента ДНК- полимеразы. В итоге число фрагментов растет в геометрической прогрессии. Примерно 30–40 циклов и их число превышает несколько миллиардов, что позволяет обнаружить их различными методами.
Данная техника позволяет с высокой точностью выявить точечные мутации, количественное содержание ДНК в пробе, а также для определения уровня экспрессии генов. ПГД на определенные моногенные заболевания проводится в том случае, если в семье встречались случаи данного заболевания.
Возможности:
— возможность выполнения всех видов ПГД;
— позволяет детектировать уровень мозаицизма порядка 20–30 %;
— относительная дешевизна и возможность одновременного анализа гораздо большего количества образцов;
— скорость выполнения исследований;
— экономия затрат времени и труда.
Ограничения:
— способен лишь обнаруживать специфические хромосомные изменения, не позволяя проводить детекцию нарушений, лежащих вне пределов, ограниченных праймерами;
— большая трудоемкость подготовительного этапа;
— отсутствие коммерческих наборов.
Выводы : ПГД развивается уже более 20 лет, за это время произошел значительный прогресс техник экстракорпорального оплодотворения, появились новые методы и оборудование, позволяющие расширить диапазон возможностей ВРТ. Благодаря этому ПГД превратилась из экспериментальной процедуры в действенную и самую раннюю форму преимплантационной диагностики. [2]
Литература:
- Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения как способ профилактики наследственной патологии / И. Н. Фетисова, А. И. Малышкина, С. С. Семененко [и др.]. — Текст: непосредственный // Вестник ИвГМА. — 2018. — № 3. — С. 10–13.
- Логинова Ю. А. Современные возможности преимплантационной генетической диагностики / Ю. А. Логинова, О. Г. Чиряева. — Текст: непосредственный // журнал акушерства и женских болезней. — 2012. — № 3. — С. 75.
