После длительного и тщательного изучения вирусных методов получения человеческих индуцированных плюрипотентных клеток, стали искать другие. Использовали ДНК-плазмиды, мини-циклы, матричные-РНК, микроРНК, а также такой способ как липосомальная магнификация, но каждый из этих способов даже в модификации не смог дать нужный результат — доступное, эффективное и безопасное получение иПСК.
Начнем с ДНК-плазмид, которые содержат в себе перепрограммирующие факторы Яманаки Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Несмотря на то, что векторы индукции присутствуют в клетке в течение нескольких клеточных циклов, они не интегрируются в геном и не экспрессируют перепрограммирующие факторы, поэтому необходимы повторные трансфекции плазмид (Okita K. et al., 2011). Использование эписомных плазмид считается наиболее эффективным и безопасным, так как не требует интеграции трансгенов в геном (Linzhao Cheng et al. 2012; Kime C. et al.2015; Zhang W., 2012), при этом, если говорить об эффективность перепрограммирования, то она была крайне низкой (менее 0,0002 %). Увеличить эффективность индукции иПСК стало возможно при помощи комбинации плазмид, кодирующих OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 и малой интерферирующей РНК для ингибирования гена TP53, кодирующего белок p53 в сочетании с Эпштейн-Барр ядерным антигеном 1 (EBNA1), который является белком вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), необходимым для амплификации эписомных векторов (Okita K. et al., 2012). Кроме этого были разработаны полицистронные свободные от вирусов плазмиды, которые содержат последовательности самовыщепляющегося 2A пептида (Kim J. H., Lee S. R., et al. 2011; Gao S. Y.et al. 2012) и постоянно активный промотор вируса энцефаломиокардита (Qu X., Liu T., et al.2012). Однако исследования показали, что фрагменты эписомальных векторов распознаются как часть собственной ДНК клетки и включаются в геном (Schlaeger et al., 2015; Стефани Клингенштейн и др. 2020). ИПСК, человека полученные из дермальных фибробластов, полученных от пациента с пигментным ретинитом, вызванным мутацией CRB1, с использованием эписомальных плазмид, содержащих OCT4, SOX2, LIN28, KLF4, L-MYC и mp53DD смогли экспрессировать маркеры плюрипотентности, имели нормальный кариотип и демонстрировали способность дифференцироваться на три первичных зародышевых листка, а также органоиды сетчатки (Сан Юн Мун и др., 2021).
Следующим методом в изучение безвирусных стратегий стало использование мини-циклов, то есть векторов, которые не связанны с ДНК-несущими плазмидами. Они содержат эукариотический промотор и комплементарную ДНК (cDNA) для экспрессии, а также обладают небольшим молекулярным размером, таким образом, предоставляя более длительную экспрессию факторов по сравнению, к примеру, с теми же плазмидами (F. Jia et. al., 2010). Полученные таким образом перепрограммирование hASC на основе мини-кольца, является преимуществом для получения свободных от трансгенов hiPSC (Казим Х. Нарсин 2011), также нужно учесть, что эффективность перепрограммирования значительно ниже (приблизительно 0,005 %) по сравнению с непосредственно лентивирусными методами сверхэкспрессии факторов транскрипции или факторов Яманаки (OSKM). Дальнейшее улучшение этого способа стало возможным с помощью обработки небольшими молекулами, например, вальпроевой кислотой (Хуанфу Д., Маер Р., et al.2008) или клеточными сигнальными пептидами, что привело непосредственно к некоторому повышению эффективности репрограммирования.
Помимо этого исследовалась липосомальная магнификация, которая заключалась в самосборке катионных комплексов липидов и плазмид или коротких интерферирующих РНК (siRNA) с магнитными наночастицами железа. Подобные комплексы начинали концентрироваться на поверхности клеток и подвергаться воздействию магнитного поля для того, чтобы произвести введение векторов внутрь клетки (O. Mykhaylyk et. al., 2010), за счет чего значительно повышается эффективность трансфекции по сравнению с трансфекцией, проводимой немагнитными генными векторами.
В процессе поиска наиболее легкого и в то же время выгодного с разных сторон метода начали использовать матричные РНК, кодирующие коктейль Яманаки за счет катионных липидных носителей, которые осуществляли непосредственно доставку синтетических молекул, чтобы в конечном итоге получить иПСК (L.Warren et. al. 2010). Метод был изменен и в тоже время улучшен добавлением мРНК Lin28, культивацией клеток в условиях гипоксии и обогащением культуральной среды вальпроевой кислотой (Zhou H, Wu S., 2009). Однако было доказано, что эффективность данного метода ниже по сравнению с «классическими» методами репрограммирования с помощью ретровирусов или вирусов Сендай (L. Warren et. al., 2010; K. Bhutani et. al., 2016). Метод оказался технически сложен и сильно зависел от качества и количества реактивов (Warren L. et al., 2010). Через некоторое время его снова модифицировали, что позволило сократить продолжительность процесса и число необходимых реагентов (Warren L. et al. 2012). Ещё более экономным в отношении стоимости перепрограммирования является метод получения иПСК и последующего их преобразования с помощью микрожидкостного устройства не более одного микролитра и эффективностью в 50 раз большей, чем при простом первоначальном перепрограммировании путём доставки синтетических мРНК, кодирующих факторы транскрипции (Luni, C. et al. 2016; Raimes, W., et al. 2016). Для перепрограммирования in vivo подойдет доставка мРНК с помощью олиго (карбонат-b-α-амино эфиров) под общим названием CARTs (charge-altering releasable transporters), катионов, которые образуя комплекс с мРНК, защищают её и, доставив в клетку, высвобождают (McKinlay, C. J. et al. 2017).
Впервые информация о микроРНК (miRNA) появилась еще в 1993 году, где говорилось о том, что микроРНК способно регулировать экспрессию генов (Ли RC, Фейнбаум RL, Амброс V. 1993). На основе чего было выяснено, что микроРНК из семейства miR-302 в сочетании с факторами Яманаки улучшает и повышает эффективность перепрограммирования человеческих фибробластов (Анокье-Дансо F, Триведи СМ, Юр D, и другие 2011). Введение коктейля, состоящего из miR-200, т1Я-302 и miR-369 имеет возможность самостоятельно вызывать или индуцировать плюрипотентность в клетках человека. Похожие результаты были получены при применении комбинации из miR-302/367 (Анокье-Дансо F, Триведи СМ и другие 2011; D. Subramanyam et. al. 2011; N. Miyoshi et. al.2011; B. Xiao et. al. 2011). Метод неплохой, но опять-таки малоэффективный, затратный и ненадежный для широкого спектра исследований, но потенциально его можно использовать непосредственно в моделировании развития и заболеваний человеческого мозга in vitro (Сатиш Кумар и др., 2020).
Литература:
- Стефани Клингенштейн, Мориц Клингенштейн, Александр Клегер, Стефан Либау. От волос к ИПСК — Руководство о том, как перепрограммировать кератиноциты и почему. 2020 Декабрь; 55 (1): e121. DOI: 10.1002 / cpsc.121
- Казим Х Нарсин, Фанцзюнь Цзя , Роберт С. Роббинс , Марк Эй Кей , Майкл Т Лонгакер , Джозеф С Ву. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток взрослого человека с использованием невирусных миникольцевых ДНК-векторов. 2011 Янв; 6 (1): 78–88. DOI: 10.1038
- Ли RC, Фейнбаум RL, Амброс V. Гетерохронный ген lin-4 C. elegans кодирует малые РНК с антисмысловой комплементарностью lin-14.,. Клетка, 1993 г., т. 75 (стр. 843–54).
- Анокье-Дансо F, Триведи СМ, Юр D, и другие. Высокоэффективное miRNA-опосредованное перепрограммирование соматических клеток мыши и человека до плюрипотентности, Стволовая клетка, 2011 г., т. 8 (стр. 376–88).
