В настоящее время роль микроорганизмов существенно растет в силу их обширного распространения в природе. Многие биохимические процессы, протекающие в окружающей среде, происходят вследствие их активной деятельности. В особенности необходимо отметить микроорганизмы, способные использовать нефть и нефтепродукты в качестве источника углерода за счет разрушения углеводородов. Такие микроорганизмы получили название «углеводородокисляющие». Местонахождение углеводородокисляющих бактерий различно: в почве, водоемах и, в особенности, в местах, загрязненных всевозможными нефтепродуктами. В данной работе методом окрашивания по Граму был выделен ряд основных микроорганизмов, содержащихся в почве и воде; приведены основные характеристики каждого из них; сделаны выводы в соответствии с целью, которая была поставлена в данной статье.
Ключевые слова: углеводородокисляющие бактерии, почва, нефтепродукты, культивирование, питательная среда.
Введение . Известно, что на Земле существует огромное разнообразие всевозможных микроорганизмов. Их нахождение в природе носит всеобъемлющий характер, и поэтому неудивительно, что с каждым годом их роль в жизни человека стремительно растет.
Одними из основных микроорганизмов является «углеводородокисляющие». Их отличительной особенностью является то, что они способны утилизировать содержащиеся в нефти углеводороды, которые носят губительный характер в природе [1]. В процессе биоремедиации углерод из нефти и нефтепродуктов частично преобразуется в диоксид углерода, частично переходит в биомассу клеток или частично трансформируется в гумус и закрепляется в почве [2].
Среди всех мест нахождения углеводородокисляющих микроорганизмов необходимо отметить почву. Почва по своему содержанию является главным резервуаром и естественной средой обитания многих микроорганизмов [3]. В почве содержится комплекс необходимых для развития бактерий питательных веществ, а также она способна оказывать сопротивление воздействию солнечных лучей и предохранять от высыхания. Микрофлора почвы принимает активное участие в круговороте веществ в природе (азота, углерода, серы, железа и др. соединений).
Кроме того, необходимо отметить и воду, которая аналогично почве является естественной средой обитания микроорганизмов, где они способны жить, размножаться и участвовать в процессах круговорота углерода, азота, серы, железа и др. элементов [4]. В большинстве случаев микроорганизмы попадают в воду из почвы, либо из воздуха. Среди них известны такие микроорганизмы, как Azotobacter , Nitrobacter , Microccus roseus , Pseudomonasfluorescens , Spirillum и др.
Цель . Целью данной работы являлось выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из мест их естественного обитания (почва и вода) и идентификация каждого из них.
Методы и материалы. Вкачестве основных компонентов исследования было использованы NH 4 NO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 ⋅7H 2 O, MnSO 4 , CaCl 2 , агар — агар.
Приготовление питательной среды
Получают жидкую питательную среду следующего состава, г/дм 3 : NH 4 NO 3– 4,0; KH 2 PO 4– 0,6; MgSO 4 ⋅7H 2 O — 0,5; MnSO 4– 0,02; CaCl 2– 0,01; pH = 6,8–7,2. Среду разливают в колбы Эрленмейера по 50 см 3 и стерилизуют при 7,8⋅10 5 Па в течение 30 минут. Нефтепродукт стерилизуют отдельно при 4,9⋅10 5 Па в течение 20 минут и вносят в раствор солей в качестве единственного источника углерода и энергии.
Для приготовления плотной питательной среды к жидкой среде добавляют агар-агар в количестве 2 %, нагревают до полного расплавления агар-агара и стерилизуют при 9,8⋅10 5 Па в течение 30 минут.
Отбор проб и пробоподготовка
Из мест, загрязненных нефтепродуктами (почва, вода), отбирают пробы, используя для этого стерильную посуду и инструменты.
Культивирование
Для получения накопительной культуры в колбы Эрленмейера вместимостью 750 см 3 с 50 см 3 стерильной синтетической среды вносят 2 см 3 стерильного нефтепродукта и инокулируют небольшим количеством почвы, загрязненной нефтепродуктом. Культивирование проводят на качалке с частотой вращения 220 об/мин при температуре 28°С в течение 7 суток.
Кроме того, делают высевы отобранных проб на чашки Петри. Для этого разливают в них среду толстым слоем. После застывания в центре агаровой пластины вырезают специальным сверлом лунку. Сверло предварительно обжигают в пламени спиртовки. Затем на поверхность агаризованной среды вносят 1–2 капли суспензии, приготовленной из загрязненной нефтепродуктами почвы, и распределяют с помощью шпателя. В лунку вносят пробу нефтепродукта и помещают чашки в термостат, не переворачивая. Инкубируют при температуре 28°С в течение 7 суток.
Результаты и обсуждение. По ходу микроскопирования были обнаружены различного рода бактерии.
Pseudomonas — одиночные прямые или слегка изогнутые подвижные палочки; движение осуществляется за счет полярно расположенных жгутиков (на конце 2–5 жгутиков); как правило, облигатно аэробные хемоорганогетеротрофы; всеядны и практически встречаются везде. Из — за того, что они грамотрицательны, колонии окрашены в оранжевый, красно — желтый цвет.
Micrococcus — маленькие сферические бактерии, которые располагаются поодиночке или в неправильных скоплениях; неспорообразующие (способны делиться в разных направлениях); могут встречаться облигатные аэробы, сапрофиты или факультативные паразиты; грамположительны; колонии могут быть белого, красного или желтого цвета.
Bacillus — подвижные палочковидные клетки; жгутики расположены перитрихиально; облигатные или факультативные аэробы; обитают в большинстве своем в почве; грамположительны.
Структура различных форм углеводородокисляющих микроорганизмов почвы представлена на рисунке 1.
Рис. 1. Микроструктура ассоциации культур, активизированных на питательной среде. Окрашивание по Граму. Препарат № 1
Mycobacterium — палочковидные клетки неправильной формы, изогнутые, встречаются поодиночке или соединены в пара/цепочки; неподвижные; сапрофиты, живущие в почве; грамположительные.
Corynebacterium — бактерии палочковидной формы; неподвижные; хемоорганогетеротрофы, преимущественно факультативные анаэробы; присутствуют практически везде; грамположительны.
Arthrobacter — бактерии, представленные в форме кокков; в основном неподвижные (виды в молодой культуре подвижны); все бактерии — облигатно аэробные хемоорганогетеротрофы; является одним из ярких обитающих в почве представителей системы микроорганизмов; грамположительны.
Nocardia — нитевидные бактерии; неподвижны; аэробы; широко распространены в почве и водоемах; грамположительны.
Не менее выраженная по характеру распространения картина представлена при микроскопировании водных микроорганизмов на рисунке 2.
Рис. 2. Микроструктура ассоциации культур, активизированных на питательной среде. Окрашивание по Граму. Препарат № 2
Вывод . В результате данной работы путем микроскопирования были зафиксированы и определены различные штаммы микроорганизмов, относящихся к «углеводородокисляющим».
На основе препарата № 1 лишний раз было доказано, что почва обладает высоким потенциалом в плане наличия в ней всевозможных микроорганизмов.
Многие микроорганизмы, обитающие в почве, также встречаются и в водоемах.
Литература:
1. Бабаев Э. Р. Биодеградация нефтезагрязнений под воздействием углеводородокисляющих микроорганизмов // НефтеГазоХимия. 2019. № 1. C. 48–51.
2. Колотова О. В., Могилевская И. В., Владимцева И. В., Ермоловский А. В. Исследование эффективности деструкции приоритетных органических загрязнителей микроорганизмами // Известия Тульского государственного университета. Науки о Земле. 2021. № 1. С. 14–30.
3. Исакова Е. А. Особенности воздействия нефти и нефтепродуктов на почвенную биоту // Colloquium — journal. 2019. № 12(36). С. 7–10.
4. Кузнецов, А.Е., Прикладная экобиотехнология: в 2 т. Т. 1 / А. Е. Кузнецов, Н. Б. Градова, С. В. Лушников, М. Энгельхарт, Т. Вайссер, М. В. Чеботаева. — М.: БИНОМ, 2015. — 672 с.
