Синтез генома — ключ от всех проблем человечества

Введение

Синтетическая геномика — это конструирование вирусов, бактерий и эухроматических клеток с синтетическими геномами. Она включает в себя два основных процесса: синтез полных геномов или хромосом и загрузку этих синтетических нуклеиновых кислот для создания вирусов или живых клеток. В статье речь будет идти только о синтезе прокариот и эукариот и как это помогает человечеству.

Цель — найти и проанализировать электронные и литературные источники о синтезе генома, с чего все началось, геном каких организмов полноценно синтезировали, что нам это дало и что нас ждет в будущем.

Результаты

На основе существующей информации по синтезу генома нами было выявлено, что в нынешнее время ученые активно работают над синтезом генома человека, но сначала они начали именно с синтеза геномов, которые гораздо меньше, чем у человека, о которых мы собрали данные.

Когда Институт Дж. Крейга Вентера (JCVI) поставил перед собой задачу секвенирования первого в истории клеточного генома, основной целью было увидеть, как можно понять жизнь клетки на основе содержания в ней генов. Команда потратила огромные усилия, чтобы аннотировать каждый ген и путь распространения Mycoplasma genitalium, но вскоре стало ясно, что существует так много генов с неизвестной функцией, что в то время эта цель была недостижима. Поскольку это был первый секвенированный геном в истории, других геномов, с которыми можно было бы сравнить, явно не было. Они подумали, что если бы у них был хотя бы еще один геном, то они могли бы провести больше идентификаций генов и получить более четкое представление о том, как геном кодирует жизнь. Они решили секвенировать самый маленький из известных клеточных геномов, полагая, что в нем будет меньше несущественных генов, что поможет в понимании первого генома. Таким образом, был секвенирован второй геном M. genitalium, у которого был самый маленький известный геном из всех видов, способных к независимому росту. Опять же, разочаровывало то, что во втором геноме было не так много генов, которые перекрывались бы с первым геномом. Стало ясно, что для получения четкого понимания жизни на уровне генома потребуется несколько десятилетий работы в этой новой области сравнительной геномики. Руководствуясь работами Гарольда Моровица, команда JCVI решила вернуться к видам микоплазм в качестве отправной точки для построения минимальных клеток. В 2002 году в JCVI были начаты две попытки, направленные на то, чтобы в конечном итоге обеспечить возможность проектирования, конструирования и загрузки минимизированного генома M. genitalium. Одна команда разработала усовершенствованные методы синтеза ДНК, которые позволили бы сконструировать синтетический геном M. genitalium объемом 583 кб(баз — 1000 нуклеотид). Другая команда пыталась разработать план загрузки синтетического генома. Синтетический геном M. genitalium был создан, начиная с кассет размером ≈5 кб. Они были собраны в пять этапов с использованием комбинации методов ферментативного соединения in vitro и рекомбинации in vivo в дрожжевых клетках. Клоны промежуточных продуктов были проверены на последовательность по мере сборки. План состоял в том, чтобы установить геном M. genitalium, содержащий маркер устойчивости к тетрациклину, в клетку Mycoplasma pneumoniae, а затем, после того как эти две клетки генома успеют разделиться, только клетки, содержащие геном M. genitalium, переживут лечение антибиотиками. M. pneumoniae тесно связан с M. genitalium. Все гены M. genitalium, за исключением пары несущественных, имеют ортологичные аналоги в геноме M. pneumoniae. Таким образом, казалось разумным предположить, что геном M. genitalium, скорее всего, будет функционировать в цитоплазме своего близкого родственника. Однако все попытки загрузить изолированные геномы M. genitalium оказались безуспешными. Из-за трудностей, связанных с работой с M. genitalium, ученый JCVI Кэрол Лартиг попыталась разработать необходимую технологию, используя более податливый набор близкородственных видов микоплазм. После двух лет экспериментов ей удалось установить изолированный геном Mycoplasma mycoides в клетку Mycoplasma capricolum. После отбора антибиотиков она выделила клетки, содержащие только полные геномы M. mycoides. M. mycoides и M. capricolum — очень близкородственные виды, которые имеют геномы ≈1 Мб и которые быстро растут. Этот более быстрый рост значительно ускорил темп экспериментов Лартига. Лартиг назвал этот процесс трансплантацией генома. Два года спустя Лартиг и др., 2009, сообщили о трансплантации генома M. mycoides, который был клонирован как центромерная плазмида дрожжей, в клетку M. capricolum, единственный ген рестрикционного фермента которой был нарушен. Поскольку M. mycoides кодирует тот же ген рестрикционного фермента, что и M. capricolum, когда изолированные геномы M. mycoides были трансплантированы в M. capricolum, участки CCATC были метилированы и не были затронуты. Для трансплантации геномов M. mycoides, выделенных из дрожжей, было важно, чтобы фермент рестрикции M. capricolum был инактивирован. К сожалению, интенсивные усилия по адаптации метода трансплантации генома M. mycoides-M. capricolum для установки генома M. genitalium путем межвидового переноса в M. pneumoniae или внутривидового переноса в другой штамм M. genitalium не увенчались успехом. В 2009 году было решено отказаться от проекта M. genitalium и вместо этого синтезировать и установить геном M. mycoides. Извлеченные уроки и усовершенствования в технологии сборки ДНК привели к тому, что синтез генома M. mycoides объемом 1,079 Мб потребовал лишь доли времени одного человека в течение нескольких месяцев по сравнению с годами, необходимыми для разработки методов и завершения сборки M. genitalium. Геном был собран в три этапа путем трансформации и гомологичной рекомбинации в дрожжах из 1078 кассет ДНК размером 1 кб. Геном был трансплантирован для получения первой клетки с химически синтезированным геномом. Эта синтетическая бактерия называлась JCVI-syn1.0. Следующим шагом в попытке сконструировать минимальную бактериальную клетку было проведение транспозонной бомбардировки для идентификации существенных и несущественных генов у M. mycoides. Это показало, что около половины генов M. mycoides были несущественными. Основываясь на этих результатах, был сконструирован редуцированный геном и синтезирован из восьми перекрывающихся сегментов точно так же, как при построении JCVI-syn1.0. Затем были сконструированы восемь различных версий генома M. mycoides, каждая из которых состояла из другого редуцированного сегмента генома и семи сегментов дикого типа. Все они были пересажены, и все они привели к жизнеспособным трансплантатам. Это указывало на то, что ни из одного из сегментов не было удалено ни одного существенного гена. В то время как каждый из восьми сокращенных сегментов генома был индивидуально жизнеспособен, полностью сведенный к минимуму геном не дал ни одной успешной трансплантации, что указывает на то, что пары несущественных генов, расположенных в разных сегментах генома, которые оба кодируют белки, выполняющие одну и ту же важную функцию. Дополнительные раунды транспозонной бомбардировки частично сведенных к минимуму геномов способствовали созданию нового сокращенного генома, который можно было бы трансплантировать.

Другим наиболее широко известным примером синтетической геномики, приводящей к созданию организмов с синтетическими геномами, является проект «Синтетический геном дрожжей» Sc2.0, более известный как проект «Дрожжи 2.0". Члены этого международного консорциума из 21 учреждения спроектировали и создали синтетические версии всех 16 хромосом Saccharomyces cerevisiae. В переработанных синтетических хромосомах отсутствуют дополнительные копии генов тРНК, интронов и транспозонов, что приводит к более эффективному синтезу хромосом при поэтапной реконструкции молекул ДНК с использованием гомологичной рекомбинации, а также обеспечивает основу для исследования роли мобильных элементов в биологии дрожжей. Другие изменения включают замену стоп-кодона TAG/TAA, позволяющую использовать нестандартные аминокислоты, и вставку многочисленных участков loxPsym для обеспечения скремблирования генома, что обеспечивает индуцируемую эволюцию и сокращение генома. В совокупности уже готовые хромосомы дрожжей 2.0 используются для изучения многочисленных вопросов о функционировании и эволюции хромосом дрожжей и эукариот. В 2022 году консорциум Sc2.0 сообщил о создании штамма дрожжей, кодирующего все 6,5 из этих синтетических хромосом, из ранее зарегистрированных штаммов, которые содержали только одну синтетическую хромосому. Это было достигнуто с помощью метода, который они назвали “Перекрестное дублирование”. Работая с этим штаммом, команда дрожжей 2.0 обнаружила неизвестные взаимодействия между синтетическими хромосомами, связывающие регуляцию транскрипции, метаболизм инозитола и количество tRNASerCGA.

Искусственные хромосомы млекопитающих можно было бы использовать для создания противораковых препаратов на клеточной основе или изменять геномы животных таким образом, чтобы они производили очеловеченные органы или фармацевтические препараты. Искусственные хромосомы растений могли бы обеспечить получение улучшенных продуктов питания или растений с новыми метаболическими путями, требующими большого количества добавленных генов. Совсем недавно появились новые подходы к созданию полностью синтетических искусственных хромосом млекопитающих. Важнейшими проблемами для этой технологии являются создание функциональных синтетических центромер и обеспечение возможности менделевского наследования синтетических хромосом посредством мейотической передачи. Мейотическая передача синтетических хромосом, возможно, является более сложной проблемой. В настоящее время не известно о каких-либо попытках создать синтетические хромосомы млекопитающих, которые действительно функционируют как хромосомы в мейозе. Исследования с использованием урезанных естественных хромосом растений показали, что маленькие хромосомы не спариваются должным образом при мейозе. Возможным решением этой проблемы является конструирование хромосом таким образом, чтобы способствовать рекомбинации сестринских хроматид. Синтетические хромосомы, размер которых может превышать 10 Мб, затем можно было бы осторожно перенести, чтобы не нарушить искусственную хромосому, высшим эукариотам путем слияния сферопластов дрожжей с клеткой-мишенью, используя полиэтиленгликоль (PEG) для опосредования слияния. Таким образом, ДНК не обязательно пересекать какие-либо клеточные мембраны в процессе переноса.

Заключение

Синтетическая геномика — все еще молодая область, в которой все еще предпринимается ограниченное количество усилий. Надеемся, что синтетические клетки станут более осуществимыми благодаря новым подходам к синтезу ДНК. Если одновременно можно будет создавать и тестировать тысячи версий, область будет продвигаться вперед по крайней мере на порядок быстрее. При всем регулировании на уровне генов и геномных систем дизайн будет в значительной степени зависеть от метода проб и ошибок и способности быстро тестировать несколько версий. Проектирование и конструирование генома может привести к новой промышленной революции в производстве пищевых продуктов и химикатов. Это будет иметь ключевое значение для разработки клеточных механизмов, ограничивающих жизнеспособность синтетических организмов лабораторными и производственными установками. Аналогичным образом, изменение генетического кода синтетических организмов может устранить опасения по поводу того, что потенциально опасные гены в синтетическом штамме будут горизонтально перенесены в природные организмы и экспрессироваться.

1. Expanding and reprogramming the genetic code// Nature. 2017- P. 53–60
2. Design of a synthetic yeast genome// Science. 2017 — P. 1040–1044
3. Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome// Nature. 2019- P. 514–518
4. Replicating minichromosomes as a new tool for plastid genome engineering// Nat. Plants. 2021- P. 932–941
5. Human artificial chromosome with regulated centromere: a tool for genome and cancer studies. //ACS Synth. Biol. 2018- P. 1974–1989
6. The Bitome: digitized genomic features reveal fundamental genome organization// Nucleic Acids Res. 2020 — P. 10157–10163
7. In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes// Nat. Commun. 2020 — P. 904
8. Genome-wide Synthetic microbe has fewest genes, but many mysteries// Science. 2016 — P. 1380–1381
9. De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates// Nat. Biotechnol. 2018 — P. 645–650
10. Yeast 2.0-connecting the dots in the construction of the world's first functional synthetic eukaryotic genome// FEMS Yeast Res. 2018 — P. 18