Профиль специфических антител классов IgM и IgG К SARS-CoV-2 и их взаимосвязь с показателями иммунного статуса у реконвалесцентов, перенесших COVID-19



Цель исследования — оценка профиля специфических антител классов IgM и IgG к SARS-CoV и их взаимосвязи с показателями иммунного статуса у реконвалесцентов COVID-19, через 3 месяца после выписки из стационара.

Материал и методы. Выявление специфических антител IgM и IgG в сыворотке крови проводили методом ИФА. Определение концентрации С-РБ — c помощью иммунотурбидиметрического метода. Для определения показателей IL-6 использовали «сэндвич»-вариант твердофазного ИФА. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии.

Результаты. Из 101 реконвалесцента COVID-19, через 3 месяца после выписки из стационара профиль антител IgM(+)IgG(+) обнаружен в 29,7 %, IgM(–)IgG(+) — в 38,6 % и IgM(–)IgG(–) — в 31,7 % случаев. Наиболее высокий уровень IL-6 зафиксирован в группе IgM(-)IgG(-), наименьший — в группе IgM(-)IgG(+)(р<0,001). Наиболее высокое процентное содержание CD3+CD8+ зафиксировано в группе IgM(+)IgG(+), наиболее низкое — в группе IgM(-)IgG(-) (р<0,001). Наиболее высокие показатели CD3+CD4+,CD3–CD16+CD56+ и СД3-CD19+ наблюдались у реконвалесцентов в группе IgM(-)IgG(-), наиболее низкие — в группе IgM(+)IgG(+)(р<0,001). Группа IgM(-)IgG(+) характеризовалась ростом числа лимфоцитов, экспрессирующих молекулы поздней активации/апоптоза, в то время как наиболее низкие значения параметра регистрировались в группе IgM(+)IgG(+) (р<0,001).

Заключение. Полученные данные могут иметь потенциальное значение в клинической практике для разработки прогноза развития эпидемиологической ситуации, а также для планирования мероприятий по профилактике COVID-19.

Keywords: COVID-19, специфические антитела, иммунный статус, CD4- и CD8-Т-лимфоциты памяти, иммунитет от реинфекции SARS-CoV-2.

Introduction

SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) — новый штамм коронавирусов, выявленный в конце 2019 года индуцирующий опасное инфекционное заболевание — Corona Virus Disease 2019 (COVID-19). Начавшись с единичного случая заболевания на рынке морепродуктов в Ухани (КНР), инфекция стремительно распространилась по миру, охватив практически все государства. После глобального распространения SARS-CoV-2, ВОЗ объявила COVID-19 чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения, имеющей международное значение [1].

Всемирные исследования позволили уточнить представления о клинике, диагностике и терапии пациентов с COVID-19 [2,3], однако патогенез инфекции SARS-CoV-2 до конца не выяснен. Литературные данные свидетельствуют, что в патогенез COVID-19 вовлечены как гуморальный, так и клеточный иммунитет [4]. Так, согласно данным Sethuraman N. et al. [5], у большинства инфицированных SARS-CoV-2 специфические антитела различных классов появляются спустя 1–2 недели после появления клинических симптомов. В исследовании Long Q. X. et al [6] сероконверсия к 5–7 дню установлена у 40–50 % больных COVID-19, а спустя 17–19 дней обнаруживалась у 100 % больных. При этом к 27 дню от начала симптомов сероконверсия сопровождалась нарастанием титра антител в 2–4 раза.

Параллельно с антительным ответом активно вырабатывается и клеточный иммунитет к SARS-CoV-2. В течение 2–4 недель после инфицирования формируется пул вирусспецифичных Т-лимфоцитов [7, 8]. Предполагается, что CD4- и CD8-Т-лимфоциты памяти смогут обеспечить надежный иммунитет от реинфекции SARS-CoV-2 для индивидов, у которых не выявлены антитела.

Однако необходимо отметить, что в доступной литературе преимущественно обсуждаются особенности сероконверсииу пациентов с COVID-19 в остром периоде. В то время как представлены единичные работы, в которых рассматривается специфика иммунного ответа к SARS-CoV-2 в период реконвалесценции [9,10], имеющего важное научное и практическое значение. При этом результаты фрагментарны, недостаточны для однозначных выводов, что вероятно, обусловлено различием выборок и методических подходов к организации исследований. Актуален вопрос о связи профилей специфических антител к SARS-CoV и характеристиками иммунного статуса.

Цель исследования — оценка профиля специфических антител классов IgM и IgG к SARS-CoV и их взаимосвязи с показателями иммунного статуса у реконвалесцентов COVID-19, через 3 месяца после выписки из стационара.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Исследование включало два этапа. На первом этапе проводили оценку профиля специфических IgM и IgG антител к SARS-CoV-2 в сплошной выборке реконвалесцентов COVID-19, через 3 месяца после выписки из стационара. Второй этап представлял собой одномоментное сравнительное проспективное исследование реконвалесцентов COVID-19 с целью оценки взаимосвязи различных профилей IgM и IgG с показателями иммунного статуса.

Методом сплошной выборки в исследование был включен 101 реконвалесцент, перенесший COVID-19 (женщины — 69 (68,3 %), мужчины — 32 (31,7 %); средний возраст — 52,4±12,4 лет), соответствующих критериям включения/исключения.

Для проведения второго этапа исследования из общей выборки реконвалесцентов, перенесших COVID-19, были отобраны 78 лиц (женщины — 56 (71,4 %), мужчины– 22 (31,3 %) средний возраст — 51,8±12,6 лет), которые в зависимости от профиля специфических антител классов IgM и IgG к SARS-CoV-2 в сыворотке крови были распределены в три группы, сопоставимые по полу, возрасту, степени тяжести COVID-19 и коморбидной соматической патологии: группа IgM(+)IgG (+) — n=24, группа IgM(-)IgG(+) — n=29, группа IgM(-)IgG(-) — n=25.

Контрольную группу составили 50 добровольцев (женщины — 36 (72,0 %), мужчины– 14 (28,0 %), средний возраст — 52,1±11,9 лет).

Исследование было выполнено согласно стандартам надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и требованиям Хельсинской Декларации Всемирной Медицинской Ассоциации. Проводимые исследования были одобрены Этическим комитетом Крымской медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымскмй федеральный университет им. В. И. Вернадского». Перед включением в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследование: возраст от 18 до 70 лет; установленный диагноз COVID-19 в анамнезе; срок выписки из стационара 3 месяца; два последовательных отрицательных ПЦР-теста на COVID-19; письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: срок выписки из стационара менее 3 месяцев; положительный результата ПЦР-теста на COVID-19; перенесенные инфекционные заболевания и оперативные вмешательства за предшествующие 3 месяца до исследования; наличие иммунодефицитных состояний; онкологические заболевания; беременность и период лактации; отказ пациента от участия в исследовании.

Критерии включения в группу контроля: добровольцы сопоставимые с реконвалесцентами COVID-19 по возрасту и полу; отсутствие в анамнезе COVID-19, онкологических и иммунодефицитных заболеваний, аллергических и воспалительных реакций на момент исследования; информированное согласие на участие в исследовании.

Методика обследования

Выявление специфических антител классов IgM и IgG к SARS-CoV-2в сыворотке крови проводили методом иммунноферментного анализа с использованием набора реагентов «ДС-ИФА-Анти-SARS-CoV-2-М» и «ДС-ИФА-Анти-SARS-CoV-2-IG» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород, Россия).

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител с двойной меткой: CD3+CD19–, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3-CD16+CD56+, CD3–CD19+, CD3+CD95+, CD3+CDHLA-DR+ (Becton Dickinson, США), CD3-FITC/CD95-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE (Beckman Coulter, Франция) на аппарате «Particle Analysing System-III».

Определение концентрации С-РБ в сыворотке крови проводили c помощью иммунотурбидиметрического метода на биохимическом анализаторе AU 480 (Beckman Coulter, США) с применением оригинального реагента. Для определения показателей IL-6 в сыворотке крови использовали «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа (биотин-стрептавидиновая система усиления сигнала и тест-системы фирмы ЗАО Вектор-Бест г. Новосибирск).

Статистический анализ

Статистическая обработка полученных данных была выполнена с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSoft.Inc., USA). В качестве описательных статистик для количественных величин применяли среднее значение (М) и стандартное отклонение (σ (±)). Различия считали статистически значимыми р<0,05.

Результаты

Оценка профилей специфических антител IgM/IgG к SARS-CoV.

Характеристика 101 реконвалесцента, перенесшего COVID-19, сплошной выборки представлена в табл.1.

Таблица 1

Характеристика реконвалесцентов COVID-19 сплошной выборки

Показатель	IgM(+)IgG(+) (n= 30)	IgM(-)IgG(+) (n=39)	IgM(-)IgG(-) (n=32)	p
Возраст, лет (M± σ)	43,4± 12,4	39,1±9,4	54,6±11,1	р 1–2 =0,110 р 1–3 <0,001 р 2–3 <0,001
Женщины (n, %)	21 (70,0)	28 (71,7)	22 (68,8)	р 1–2 =0,710 р 1–3 =0,714 р 2–3 =0,222
Мужчины (n, %)	9 (30,0)	11 (28,3)	10 (31,2)	р 1–2 =0,729 р 1–3 =0,800 р 2–3 =0,812
Легкое течение (n, %)	10 (33,3)	11 (28,2)	15 (46,8)	р 1–2 =0,710 р 1–3 =0,714 р 2–3 =0,020
Среднетяжелое течение (n, %)	13 (43,4)	19 (48,7)	16 (50,0)	р 1–2 =0,215 р 1–3 =0,826 р 2–3 =0,871
Тяжелое течение (n, %)	7 (23,3)	9 (23,1)	1 (3,1)	р 1–2 =0,801 р 1–3 =0,041 р 2–3 =0,028
ХКВЗ (n, %)	3 (10,0)	4 (10,3)	11(34,4)	р 1–2 =0,710 р 1–3 =0,044 р 2–3 =0,030
Сахарный диабет (n, %)	3 (10,0)	2 (5,1)	9 (28,1)	р 1–2 =0,770 р 1–3 =0,130 р 2–3 =0,020
Гипо- и гипертиреоз (n, %)	9 (30,0)	1 (2,6)	2 (6,3)	р 1–2 =0,004 р 1–3 =0,032 р 2–3 =0,870

Note: ХКВЗ — хронические кардиоваскулярные заболевания.

Профиль специфических антитела IgM(+)IgG(+) обнаружен у 30 (29,7 %), IgM(–)IgG(+) — у 39 (38,6 %) и IgM(–)IgG(–) — 32 (31,7 %) лиц. Представленные данные позволяют отметить, что в группах не наблюдалось отличий доли женщин и мужчин.

Реконвалесценты в группе IgM(–)IgG(–) по сравнению с реконвалесцентами в группах IgM(–)IgG(+) и IgM(+)IgG(+) отличались значительно старшим возрастом (р<0,001, р<0,001), более низкой представленностью тяжелого течения COVID-19 (р=0,041, р=0,028) и более высокой представленностью кардиоваскулярной патологии (р=0,044, р=0,030 соответственно).

Реконвалесценты в группе IgM(+)IgG(+) по сравнению с реконвалесцентами в группе IgM(–)IgG(–) отличались более высокой представленностью заболеваний щитовидной железы (гипотиреоз, гипертиреоз) (р=0,032).

Реконвалесценты в группе IgM(–)IgG(+) посравнению с реконвалесцентами в группе IgM(–)IgG(–) отличались более низкой представленностью сахарного диабета (р=0,020).

Клиническая характеристика реконвалесцентов сравнительного исследования. Характеристика 78 реконвалесцентов, перенесших COVID-19, представлена в табл.2.

Таблица 2

Характеристика реконвалесцентов COVID-19, включенных в сравнительное исследование

Показатель	IgM(+)IgG(+) (n=24)	IgM(-)IgG(+) (n=29)	IgM(-)IgG(-) (n=25)
Возраст, лет (M±m)	48,4± 12,7	50,1±11,4	52,6±11,9
Женщины (n, %)	17 (70,8)	21 (72,4)	18 (72,0)
Мужчины (n, %)	7 (29,2)	8 (27,6)	7 (28,0)
Легкое течение (n, %)	10 (41,7)	10 (33,3)	9 (36,0)
Среднетяжелое течение (n, %)	11 (45,8)	16 (55,2)	15 (60,0)
Тяжелое течение (n, %)	3 (12,5)	4 (13,8)	1 (4,0)
ХКВЗ (n, %)	2 (8,3)	3 (10,3)	4 (16,0)
ХРЗ (n, %)	3 (12,5)	4 (13,8)	3 (12,0)
ХЦВЗ (n, %)	1 (4,2)	1 (3,4)	1 (4,0)
Сахарный диабет (n, %)	2 (8,3)	1 (3,4)	3 (12,0)
Гипо- и гипертиреоз (n, %)	3 (12,5)	1 (3,4)	1 (4,0)

Note: ХКВЗ — хронические кардиоваскулярные заболевания, ХРЗ — хронические респираторные заболевания, ХЦВЗ — хронические цереброваскулярные заболевания.

Среди обследованных значительно преобладали женщины — 56 (71,4 %) в возрасте 54,1± 9,2 лет. Большинство –42 (53,8 %) лиц перенесли среднетяжелое течение COVID-19. В структуре коморбидной патологии преобладали хронические респираторные и кардиоваскулярные заболевания — у 10 (12,8 %) и 9 (11,5 %) реконвалесцентов соответственно.

Сравнительная оценка уровня C-РБ, IL-6 в зависимости от профиля специфических антител IgM/IgG к SARS-CoV. Значения C-РБ в сыворотке крови всех реконвалесцентов COVID-19, через 3 месяца после выписки из стационара находились в пределах нормативных значений. Наиболее высокий уровень IL-6 в сыворотке крови зафиксирован у реконвалесцентов в группе IgM(-)IgG(-), а наименьшим этот показатель был у реконвалесцентов в группе IgM(-)IgG(+) (р<0,001) (табл.3).

Таблица 3

Сравнительная оценка уровня C-РБ и IL-6 в зависимости от профиля специфических антител IgM/IgG к SARS-CoV у реконвалесцентов COVID-19 (M±σ)

Показатель	Здоровые доноры (n=50)	Сплошная выборка (n=78)	IgM(+)IgG(+) (n=24)	IgM(-)IgG(+) (n=29)	IgM(-)IgG(-) (n=25)
С-РБ, мг/л	3,6±0,7	3,5±0,9 р 1–2 =0,51	3,6±2,7 р 1–3 =1,00 р 2–3 =0,78	3,4±1,1 р 1–4 =0,33 р 2–4 =0,63 р 3–4 =0,72	3,5±0,5 р 1–5 =0,53 р 2–5 =1,00 р 3–5 =0,86 р 4–5 =0,67
IL-6, пг/мл	4,2±7,8	8,1±4,4 р 1–2 <0,001	7,3±2,4 р 1–3 =0,062 р 2–3 =0,40	6,3±1,6 р 1–4 =0,16 р 2–4 =0,034 р 3–4 =0,076	10,6±5,5 р 1–5 <0,001 р 2–5 =0,022 р 3–5 =0,0096 р 4–5 <0,001

Сравнительная оценка иммунологических показателей в зависимости от профиля специфических антител IgM/IgG к SARS-CoV. Показатель CD3+ в сыворотке крови всех реконвалесцентов COVID-19, через 3 месяца после выписки из стационара находился в пределах нормативных значений. Сравнительный межгрупповой анализ процентного содержания CD3+CD8+ в плазме крови показал, что у реконвалесцентов в группе IgM(+)IgG(+) наблюдалось наиболее высокое содержание, у реконвалесцентов в группе IgM(-)IgG(-) — наиболее низкое (р<0,001). При межгрупповом сравнении показателей CD3+CD4+, CD3–CD16+CD56+ и CD19+ в плазме крови, у реконвалесцентов в группе IgM(-)IgG(-) установлен наиболее высокий уровень, у реконвалесцентов в группе IgM(+)IgG(+) — наиболее низкий (р<0,001). Группа реконвалесцентов с профилем антител IgM(-)IgG(+) характеризовалась ростом числа лимфоцитов, экспрессирующих молекулы поздней активации/апоптоза (HLA-DR, CD95), в то время как наиболее низкое значение исследуемого параметра регистрировалось у реконвалесцентов в группе IgM(+)IgG(+) (р=0,019,р<0,001) (табл.4).

Таблица 4

Сравнительная оценка иммунологических показателей в зависимости от профиля специфических антител IgM/IgG к SARS-CoV у реконвалесцентов COVID-19 (M±σ)

Показатель	Здоровые доноры (n=50)	Сплошная выборка (n=78)	IgM(+)IgG(+) (n=24)	IgM(-)IgG(+) (n=29)	IgM(-)IgG(-) (n=25)
CD3+, %	73,3±7,4	72,2±7,2 р 1–2 =0,41	71,1±10,7 р 1–3 =0,31 р 2–3 =0,56	73,5±8,8 р 1–4 =0,91 р 2–4 =0,44 р 3–4 =0,37	74,4±10,6 р 1–5 =0,60 р 2–5 =0,24 р 3–5 =0,28 р 4–5 =0,73
CD3+CD4+, %	46,1±4,1	50,1±4,9 р 12 <0,001	38,4±4,7 р 13 <0,001 р 23 <0,001	40,6±5,2 р 14 <0,001 р 24 <0,001 р 34 =0,12	71,4±4,8 р 15 <0,001 р 25 <0,001 р 35 <0,001 р 45 <0,001
CD3+CD8+, %	25,9±5,5	41,0±8,9 р 12 <0,001	52,7±7,2 р 13 <0,001 р 23 <0,001	40,6±10,2 р 14 <0,001 р 24 =0,84 р 34 <0,001	29,6±9,2 р 15 <0,001 р 25 <0,001 р 35 <0,001 р 45 <0,001
CD3–CD16+CD56+, %	10,4±4,8	22,4±6,9 р 1–2 <0,001	17,7±7,4 р 1–3 <0,001 р 2–3 <0,001	19,9±6,9 р 1–4 <0,001 р 2–4 =0,10 р 3–4 =0,27	29,7±6,3 р 1–5 <0,001 р 2–5 <0,001 р 3–5 <0,001 р 4–5 <0,001
CD19+, %	10,8±3,1	15,2±4,4 р 1–2 <0,001	11,3±3,0 р 1–3 =0,51 р 2–3 <0,001	14,2±3,8 р 1–4 <0,001 р 2–4 =0,28 р 3–4 =0,0038	20,2±6,3 р 1–5 <0,001 р 2–5 <0,001 р 3–5 <0,001 р 45 <0,001
CD95+, %	20,4±7,1	28,7±4,1 р 1–2 <0,001	27,2±4,0 р 1–3 <0,001 р 2–3 =0,12	29,6±3,2 р 1–4 <0,001 р 2–4 =0,29 р 3–4 =0,019	29,5±5,0 р 1–5 <0,001 р 2–5 =0,42 р 3–5 =0,083 р 4–5 =0,93
HLA-DR+, %	15,5±4,0	16,3±3,6 р 1–2 =0,24	14,0±2,8 р 1–3 =0,10 р 2–3 =0,0050	20,0±4,2 р 1–4 <0,001 р 2–4 <0,001 р 3–4 <0,001	14,8±3,8 р 1–5 =0,47 р 2–5 =0,076 р 3–5 =0,41 р 4–5 <0,001

Обсуждение

На сегодняшний день выполнено достаточно исследований, уточняющих особенности сероконверсии у пациентов с COVID-19 в остром периоде [4–6, 11], однако вопрос о специфике иммунного ответа в период реконвалесценции остается открытым. Настоящее исследование посвящено изучению различных профилей специфических антител IgM и IgG к SARS-CoV и их взаимосвязи с показателями иммунного статуса у реконвалесцентов COVID-19 через 3 месяца после выписки из стационара.

Согласно традиционным представлениям современной иммунологии, выявление у пациентов IgM антител к инфекционным агентам принято рассматривать как свидетельство острого периода или недавно перенесенного заболевания, в то время как обнаружение IgG говорит уже о формирующемся длительном иммунитете к специфическому антигену. Наше исследование показало, что специфические антитела IgG к SARS-CoV-2 выявлялись более чем у половины реконвалесцентов через 3 месяца после выписки из стационара — в 68,3 % случаев. Полученные нами результаты согласуются с данными ранее проведенного исследования Поповой А. Ю. и соавт. [12], установивших, что IgG к SARS-CoV-2 обнаруживаются у 48,7- 87,7 % лиц, перенесших манифестную форму COVID-19. Стоит отметить, что серологический ответ на коронавирусы — временный. Антитела к другим коронавирусам человека, как правило, исчезают в течение нескольких месяцев после инфекции. Ранее опубликованные данные показывают, что профиль антител к SARS-CoV-2 сходен с таковым к SARS-CoV [13]. В нашем исследовании через 3 месяца после выписки из стационара IgM-антитела обнаружены у 29,7 % реконвалесцентов, перенесших COVID-19. Отсутствие специфических IgM и IgG антител наблюдалось у 31,7 % реконвалесцентов COVID-19. Аналогично нашим результатам, в ранее выполненных исследованиях также сообщалось об отсутствии антител у пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Так, в работе Tan W. E. et al. [14] отсутствие специфических антител в периоде реконвалесценции регистрировалось у 10–20 % лиц. Сходные данные отмечены в исследовании Shen Y. et al. [10], согласно которым через 6 месяцев после выписки из стационара специфические антитела к SARS-CoV-2 отсутствовали у 36,4 % реконвалесцентов. В научном мире существует предположение, что отсутствие IgG в отдаленном периоде может свидетельствовать о легком течении SARS-CoV-2, который был эффективно элиминирован компонентами неспецифической иммунной системы. В тоже время врожденный иммунитет не обеспечивает формирование долговременной иммунной памяти [15].

Результаты нашего исследования показали отсутствие гендерных различий в отношении профиля антител к SARS-CоV-2. Полученные нами данные согласуются с результатами ранее проведенного исследования, согласно которому серопозитивность не имела статистически значимых половых различий [16]. Отмеченные в работе Поповой А. Ю. и соавт. [12] максимальные показатели серопозитивности у лиц старше 60 лет в нашем исследовании не подтвердилась. В нашем исследовании особенности гуморального ответа были связаны с возрастом, тяжестью госпитализации, спецификой хронической соматической патологии. Необходимо отметить, что серонегативные реконвалесценты на SARS-CoV-2 отличались значительно старшим возрастом, более низкой представленностью тяжелого течения COVID-19, более высокой представленностью кардиоваскулярной патологии и сахарного диабета. В настоящее время не представляется возможным дать исчерпывающее объяснение данных особенностей, что требует дополнительного углубленного изучения.

Учитывая полученные нами данные о вариабельности реакций гуморального звена иммунной системы, возникает необходимость изучения особенностей иммунного статуса у реконвалесцентов COVID-19 в зависимости от профиля IgM/IgG к SARS-CoV-2 в сыворотке крови.

При инфекционных патологиях, в том числе при COVID-19, активация популяции альвеолярных макрофагов, дендритных, иммунных и эндотелиальных клеток сопровождается повышенной продукцией молекулярных воспалительных маркеров [17]. Ключевая роль в патогенезе SARS-CоV-2 принадлежит именно IL-6, который по механизму положительной обратной связи активирует Т-лимфоциты и другие иммунокомпетентные клетки, регулирующие локальный и системный воспалительный процесс [18]. Кроме того, в аспекте COVID-19 особое диагностическое значение приобретает увеличение содержания «суррогатного» биомаркера IL-6 — острофазного С-реактивного белка, отражающего не только гиперпродукцию провоспалительных медиаторов, но и ассоциированного со степенью тяжести заболевания [19–21]. В настоящем исследовании показано, что у всех реконвалесцентов COVID-19, через 3 месяца после выписки из стационара значения С-РБ находились в пределах нормативных значений, что согласуется с данныи предыдущих исследований [10]. Значения IL-6 у реконвалесцентов c профилем IgM(-)IgG(-) превышали референсные значения и были в 1,7 раза выше по сравнению с результатами в группе IgM(+)IgG(+) и IgM(-)IgG(+), что не в полной мере укладывается в общепринятые представления о снижении концентрации провоспалительных медиаторов в период выздоровления после перенесенного инфекционного процесса и подчеркивает необходимость дополнительного изучения вопроса.

Анализируя показатели иммунного статуса у IgM(+) реконвалесцентов, некоторые исследователи связывают длительно сохраняющийся уровень специфических IgM с поражением функции Т-хелперов (CD3+CD4+ лимфоцитов), необходимых для переключения продукции IgM на IgG, а также снижением общего количества Т-лимфоцитов и клеток-супрессоров, что позже может провоцировать неконтролируемый гиперответ на вирус [22]. В нашем исследовании оценка клеточного звена иммунитета показала, что присутствие IgM-антител в сыворотке крови реконвалесцентов, перенесших COVID-19, было сопряжено со значительным снижением относительного содержания CD3+CD4+ лимфоцитов и статистически значимым увеличением процентного содержания CD3+CD8+ по сравнению с показателями здоровых доноров и групп IgM(-)IgG(-) и IgM(-)IgG(+) на фоне сохранения нормативных значений общего количества Т-лимфоцитов (СД3+). Мы полагаем, что снижение численности СД3+СD4+ субпопуляции лимфоцитов у лиц, перенесших COVID-19, демонстрирует недостаточный Т-клеточный пролиферативный ответ на антигены коронавируса, а увеличение цитотоксического потенциала иммунной системы может отражать повышенный уровень бактериальной нагрузки IgM+ у пациентов.

В группе IgG(–) реконвалесцентов, несмотря на отсутствие специфических антител, клеточный иммунный ответ характеризовался увеличением относительного содержания CD3+CD4+ клеток и снижением CD3+CD8+ лимфоцитов на фоне нормальных значений содержания пула СД3+ клеток. Это может быть косвенным свидетельством продолжающейся вирусной перистенции, которая реализуется посредством сокращения экспрессии собственного генома ниже порога видимости Т-эффекторов либо инфицирования иммунологически привилегированных тканей.

Значительная роль в реализации противовирусного иммунитета принадлежит врожденным лимфоидным клеткам. Так, в частности NK-клетки, экспрессируя на своей поверхности ингибиторные и активирующие рецепторы, регулирующие их цитотоксичность, способны индуцировать лизис инфицированных клеток, для которых характерна повышенная экспрессия белков вирусного происхождения, а также стрессиндуцированных лигандов, которые затем распознаются рецепторами, активирующими NK-клетки [23,24]. Ряд зарубежных исследований свидетельствует о сокращении количества NK-клеток в периферической крови в остром периоде пациентов с COVID-19, что ассоциируется со степенью тяжести заболевания [25, 26].

В работе Amanat et al., продемонстрировано, что секреция антител IgG1 и IgG3 при инфицировании SARS-CoV-2 может индуцировать активацию и врожденных лифоидных NK-клеток CD56dimCD16+ через распознавание Fc-рецепторами антител, связанных либо с поверхностными антигенами, экспрессированными на инфицированных клетках, либо с внеклеточными вирионами в составе иммунных комплексов Возможно, это взаимодействие провоцирует как выработку цитокинов NK-клетками, так и лизис инфицированных клеток в результате антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), как это наблюдается при гриппозной инфекции [27].

В нашей работе показано, что наиболее значимое снижение пула СД3-СД16+СД56+ клеток в сыворотке крови через 3 месяца после выписки из стационара отмечалось лишь у реконвалесцентов с сохраняющимися IgM антителами, в то время как в группе серонегативных реконвалесцентов регистрировалось статистически значимое повышение относительного содержания NK-клеток. Таким образом, наличие в сыворотке крови реконвалесцентов специфических IgG и IgM антител через 3 месяца после выписки из стационара, регистрируемое на фоне дисбаланса иммунной системы, является настораживающим фактором в отношении риска развития аутоиммунных реакций.

На сегодняшний день известно, что именно В-клеточный ответ имеет решающее значение для устранения цитопатических вирусов и является важнейшей частью вторичного иммунного ответа, предотвращающего реинфекцию.

По полученным нами данным, у реконвалесцентов IgG(-) регистрировались более высокие статистически значимые показатели относительного содержания В-лимфоцитов по сравнению с таковыми у реконвалесцентов с профилем IgM(+)IgG(+) и IgM(-)IgG(+), что является несомненно неблагоприятным признаком на фоне отсутствия антителообразования.

Активационная модуляция иммунокомпетентных клеток, обусловленная воздействием патогенных вирусных агентов, характеризуется изменением репертуара поверхностных молекул, последовательно отражающих происходящие в клетке процессы активации, пролиферации, дифференцировки, апоптоза, что позволяет оценить их вклад в формирование патологического процесса. У всех обследованных нами реконвалесцентов COVID-19 через 3 месяца после выписки из стационара были выявлены признаки хронической Т-клеточной активации, сопряженной с увеличением количества CD95/Fas и экспрессии HLA-DR. При этом примечательно, что наибольшие значения апоптотических маркеров были зафиксированы у реконвалесцентов с профилем IgM(-)IgG(+), показатели иммунокомпетентных клеток которых были наиболее близки к значения здоровых доноров.

Таким образом, в результате комплексной оценки функционального состояния показателей иммунного статуса у пациентов с перенесенной коронавирусной инфекцией в анамнезе установлена вариабельность степени активации лимфоцитов периферической крови, свидетельствующая о наличии индивидуальности реакции иммунной системы. Дисбаланс клеточного иммунного ответа, регистрируемый у серонегативных пациентов, перенесших COVID-19, может быть косвенным свидетельством продолжающегося инфицирования вирусом. Наличие в сыворотке крови специфических IgG и IgM антител в отдаленные сроки после клинического выздоровления, регистрируемое на фоне дисбаланса иммунной системы, является настораживающим фактором в отношении склонности к сильному гуморальному ответу, образованию аутоантител к собственным тканям и развитию аутоиммунных реакций.

Выводы

Таким образом, полученные данные о взаимосвязи профилей специфических антител IgM и IgG к SARS-CoV-2 и иммунологических показателей у реконвалесцентов COVID-19 могут улучшить понимание специфики иммунного ответа у данного контингента в отдаленном периоде и иметь потенциальное значение в клинической практике для разработки прогноза развития эпидемиологической ситуации, а также для планирования мероприятий по специфической и неспецифической профилактике COVID-19.

Ограничения

Результаты настоящей работы необходимо интерпретировать с учетом некоторых ограничений. Во-первых, это относительно небольшой размер выборки пациентов. Другим ограничением является тот факт, что в критериях соответствия для обследованных установлены широкие возрастные рамки. Также в качестве ограничения исследования следует указать то, что в исследование вошли пациенты с коморбидной патологией в анамнезе, что не позволяет получить полную информацию о степени иммунологических нарушений у реконвалесцентов COVID-19

Литература:

1. World Health Organization. Statement on the second meeting of the International Health Regulations (2005) Emergency Committee regarding the outbreak of novel coronavirus (2019-nCoV). Available from: https://www.who.int/news-room/detail/30–01–2020-statement-on-the-second-meeting-of-the-international-health-regulations-(2005)-emergency-committee-regarding-the-outbreak-of-novel-coronavirus-(2019-ncov) (2020).
2. Huang C., Wang Y., Li X. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China // Lancet. 2020;395:497–506. https://doi.org/10.1016/S0140–6736(20)30183–5
3. Haveri A., Smura T., Kuivanen S., et al. Serological and molecular findings during SARS-CoV-2 infection: the first case study in Finland, January to February 2020. Euro Surveillance. 2020;25(11):2000266. doi: 10.2807/1560–7917.ES.2020.25.11.2000266.
4. Vabret N., Britton G. J., Gruber C., et al. Sinai Immunology Review Project. Immunology of COVID-19: Current State of the Science. Immunity. 2020;52(6):910–941. doi: 10.1016/j.immuni.2020.05.002.
5. Sethuraman N, Jeremiah SS, Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 2020;323(22):2249–2251. doi:10.1001/jama.2020.8259
6. Long Q. X., Liu B. Z., Deng H. J. et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med. 2020;26(6):845–848. doi: 10.1038/s41591–020–0897–1.
7. Melgaço J. G., Azamor T., Ano Bom APD. Protective immunity after COVID-19 has been questioned: What can we do without SARSCoV-2-IgG detection? Cell Immunol. 2020; 353: 104114. doi: 10.1016/j.cellimm.2020.104114.
8. Ni L., Ye F., Cheng M. L. et al. Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and Cellular Immunity in COVID-19 Convalescent Individuals. Immunity. 2020; 52(6): 971–977.e3. doi: 10.1016/j.immuni.2020.04.023.
9. Chaolu H., Zhang X., Li X. et al. Circulating cytokines and lymphocyte subsets in patients who have recovered from COVID-19. medRxiv. 2020;20160259. doi: 10.1155/2020/7570981.
10. Shen Y., Ba Y., Hu Y. et al. Relationship between the dynamic changes of serum 2019-nCoV IgM/IgG and patient immunity after discharged six months. 2020, PREPRINT (Version 1) available at Research Square. doi: 10.1007/s00011–020–01429–8.
11. Huang A. T., Garcia-Carreras B., Hitchings M. D. T. et al. A systematic review of antibody mediated immunity to coronaviruses: antibody kinetics, correlates of protection, and association of antibody responses with severity of disease. medRxiv. 2020;20065771. doi: 10.1038/s41467–020–18450–4.
12. Попова А. Ю., Ежлова Е. Б., Мельникова А. А. и др. Популяционный иммунитет к вирусу SARS-COV-2 среди населения Санкт-Петербурга в период эпидемии COVID-19. Проблемы особо опасных инфекций. 2020;3:124–130. https://doi.org/10.21055/0370–1069–2020–3-114–123
13. Xiao D. A. T, Gao D. C., Zhang D. S. Profile of Specific Antibodies to SARS-CoV-2: The First Report. J Infect. 2020;20:30138–9. doi: 10.1016/j.jinf.2020.03.012.
14. Tan W., Lu Y., Zhang J. et al. Viral Kinetics and Antibody Responses in Patients with COVID-19. medRxiv. 2020;20042382. doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.24.20042382
15. Смирнов В. С., Тотолян А. А. Врожденный иммунитет при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет. 2020;10(2):259–268. https://doi.org/10.15789/2220–7619-III-1440
16. Попова А. Ю., Ежлова Е. Б., Мельникова А. А. и др. Распределение серопревалентности к SARS-CоV-2 среди жителей Тюменской области в эпидемическом периоде COVID-19. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020;97(5):392–400. https://doi.org/10.36233/0372–9311–2020–97–5-1
17. Насонов Е. Л. Иммунопатология и иммунофармакотерапия коронавирусной болезни-2019 (COVID-19): фокус на интерлейкин. Научно-практическая ревматология. 2020;58(3):245–261. https://doi.org/10.14412/1995–4484–2020–245–261
18. Wen, W., Su, W., Tang, H. et al. Immune cell profiling of COVID-19 patients in the recovery stage by single-cell sequencing. Cell Discov2020. 2020; 31. doi: 10.1038/s41421–020–0168–9.
19. Yun H., Sun Z., Wu J. et al. Laboratory data analysis of novel coronavirus (COVID-19) screening in 2510 patients. ClinChimActa. 2020;507:94–7. doi: 10.1016/j.cca.2020.04.018.
20. Zheng Y., Xu H., Yang M, et al. Epidemiological characteristics and clinical features of 32 critical and 67 noncritical cases of COVID-19 in Chengdu. J ClinVirol. 2020;127:104366. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104366.
21. Zhu J., Ji P., Pang J. et al. Clinical characteristics of 3,062 COVID-19 patients: a meta-analysis. J Med Virol.2020;10. doi: 10.1002/jmv.25884.
22. Tay M. Z., Poh C. M., Rénia L. et al. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention. Nat Rev Immunol. 2020;20: 363–374. doi: 10.1038/s41577–020–0311–8.
23. Duev-Cohen A., Bar-On Y., Glasner A., et al. The human 2B4 and NTB-A receptors bind the influenza viral hemagglutinin and co-stimulate NK cell cytotoxicity.Oncotarget. 2016;7(11):13093–13105. doi: 10.18632/oncotarget.7597.
24. Glasner A., Zurunic A., Meningher T. et al. Elucidating the mechanisms of influenza virus recognition by Ncr1. PLoS One. 2012;7(5):e36837. doi: 10.1371/journal.pone.0036837.
25. Song C.-Y., Xu J., He J.-Q., Lu Y.-Q. COVID-19 early warning score: a multi-parameter screening tool to identify highly suspected patients. medRxiv. 2020;20031906. https://doi.org/10.1101/2020.03.05.20031906
26. Yu L., Tong Y., Shen G. et al. Immunodepletion with Hypoxemia: A Potential High Risk Subtype of Coronavirus Disease 2019. medRxiv. 2020 https://doi.org/10.1101/2020.03.03.20030650
27. Von Holle T. A., Moody M. A. Influenza and Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity. Front. Immunol. 2019;10:1457. doi: 10.3389/fimmu.2019.01457.