Влияние метода выделения коллагена из шкур крупного рогатого скота на его свойства

Коллаген является наиболее распространенным в природе белком животного происхождения. Коллаген не токсичен, имеет слабые антигенные свойства, способен стимулировать репаративные процессы в тканях, образовывать прочные комплексы с широким кругом лекарственных веществ.

Ключевые слова: шкуры крупного рогатого скота, коллаген, метод обработки.

Целью исследований было сравнение влияния различных методов получения коллагена на его свойства. Шкуры крупного рогатого скота подвергали предварительной обработке. Коллаген выделяли из дермы с помощью кислотного и щёлочно-солевого способа. Биотехнологический, желирующий коллаген получают в основном кислотным способом. При щелочно-солевой обработке происходит отщепление амидных групп, происходит распределение зарядов вдоль тройной спирали и щелочно-солевой коллаген теряет способность образовывать фибриллярные гели с нативной структурой. Оказалось, что при мягком воздействии, можно получить желирующие образцы.

В кислотном методе для экстракции коллагеновых белков использовали 0,5 М уксусную кислоту. В щёлочно-солевом методе обработку дермы проводили следующими растворами: 10 % NaOH на 5 М NaCl и 20 % NaOH на 5 М NaCl; 8 % NaOH в 5 М NaCl на 10 % этиловом спирте; 2,8 % NaOH в 5 М NaCl; 0,4 % NaOH. В очередной раз было доказано, что кислотный метод получения коллагена, даёт желирующий коллаген высокой прочности. Способ обработки шкур 0,4 % NaOH оказался самым оптимальным. Оказалось, что при мягком воздействии можно получить желирующие образцы.

Коллагены — это семейство весьма своеобразных фибриллярных белков; их можно найти у всех многоклеточных животных. Поскольку они являются основным компонентом кожи и костей, у млекопитающих этих белков больше всего: они составляют 25 % массы всех белков [1].

Коллаген является основным опорным белком соединительной ткани и всего организма. Биологическое значение коллагена равноценно значению и функции соединительной ткани.

Коллаген сочетает в себе положительные качества синтетического полимера и биологических тканей и при этом лишен целого ряда их отрицательных свойств: полное отсутствие токсичности и канцерогенности, слабые антигенные свойства, а также способность этого биополимера стимулировать репаративные процессы в тканях, образовывать прочные комплексы с широким кругом лекарственных веществ, его сорбционные и пластические свойства определяют широкое применение в различных областях медицины [2]. Эффективно использование коллагена для покрытия ран [3]. Коллаген широко применяется в пищевой промышленности, в производстве напитков [4, 5].

Цель исследования — сравнение влияния различных методов получения цельного коллагена с телопептидами из предварительно обезволошенных с применением протеазы из Bacillus licheniformis [6] телячьих и бычьих шкур на его свойства.

Материалы, методы и объекты исследования.

Образцы шкур крупного рогатого скота были предварительно обработаны сухим NaCl (25 % от веса) и хранились под грузом в течение двух недель. Затем шкуры высушили на штативе. Обработку и сушку проводили в холодной комнате при температуре +4 ⁰ С.Далее одни образцы заморозили, а другие хранили при комнатной температуре.Свежие шкуры заморозили.

Для получения стандартного неповрежденного коллагена (с неповрежденной тройной спиралью и в физиологических условиях при ионной силе 0,15 М, рН=7–7,5 и температуре 37 ̊С дающего гели, являющиеся по структуре аналогом соединительной ткани) был использован кислотный метод [7]. Щелочно-солевой метод даёт растворы коллагена высокой вязкости, пригодные для волокнообразования и в некоторых случаях образующие гели в физиологических условиях.

Существует метод Истранова: обработка 2,7 М NaOH c 1 М Na ₂ SO ₄ , но коллаген, полученный таким способом не желирует при физиологических условиях [8]. Чтобы получить желирующий продукт условия обработки были смягчены.

Для образцов шкур были использованы следующие щёлочно-солевые методы:

1. Бычья шкура замороженная сухо-соленая; несоленая — обработка 2,7 М NaOH и 1 М Na ₂ SO ₄ (щёлочно-солевой метод).
2. Бычья шкура замороженная сухо-соленая — обработка 8 % NaOH в 5 М NaCl на 10 % этиловом спирте.
3. Бычья шкура замороженная сухо-соленая — обработка 10 % NaOH на 5 М NaCl.
4. Бычья шкура замороженная сухо-соленая — обработка 20 % NaOH на 5 М NaCl.
5. Телячья шкура замороженная сухо-соленая; телячья шкура свежая; бычья шкура свежая; сухо — солёная замороженная — обработка 0,4 % NaOH.
6. Бычья шкура замороженная сухо-соленая — обработка 2,8 % NaOH в 5 М NaCl c 0,1 М NH ₂ OH·HCl (метод Fujii).

Пробу на желирование делали при концентрации коллагена в геле 2 мг/мл, (смешение проводили на льду, все реактивы охлажденные). К навеске, содержащей 2–3 мг коллагена добавляли 1/9 часть 10-кратного PBS (PBS- физиологический буферный раствор NaCl и фосфата натрия и калия) и столько однократного PBS, чтобы общая концентрация раствора была 2 мг/мл. pН раствора доводили до 7,4–7,5 (по индикатору феноловому красному до розового цвета 1,5 М NaOH (2–5 мкл). Нейтрализованный раствор закрывали пробкой и ставили в термостат на 20 мин. При 37 ̊С. После этого способный к желированию коллаген должен образовать гель.

Результаты исследования. Проба на желирование показала, что коллаген, полученный кислотным методом, как и следовало, ожидать желирует, а также желирует коллаген, полученный обработкой 0,4 % раствором NaOH. Все остальные проверенные способы желирующего коллагена не дали.

Было решено проверить влияние предварительной обработки шкуры перед экстакцией коллагена на выход и свойства продуктов.

Коллаген, полученный из дермы сухо — соленого теленка, держит форму лучше, чем все остальные образцы. Коллаген из дермы свежего теленка и свежего быка менее прочный, чем из дермы сухосоленого теленка, но превосходит крысиный коллаген, который использовался в качестве контроля. Коллаген, полученный из дермы сухосоленого быка желировал хуже всех образцов.

Выводы: удалось получить щелочно-солевой, желирующий коллаген, но он представляет собой не раствор, а совокупность агрегатов, но для клеточной инженерии он пригоден. Следует отметить, что лучший выход у коллагена, полученного из дермы замороженной сухо-соленой шкуры теленка, а не свежей. Вероятно, что обработка положительно влияет на выход и свойства продукта.

Все желирующие образцы обладают четкими краями.

Литература:

1. Албертс Б., Джонсон А., Льюис Д. и др. Т.3. Молекулярная биология клетки.-М.-Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика». — 2013.- С. 1815–1816.
2. Алейникова Т. Л., Авдеева Л. В., Андрианова Л. Е. Биохимия.-М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2005.- С. 693–694.
3. Койлыбаева М. К., Устенова Г. О., Мустафина К. К., Нурмухамбетова А. Б. \, Момбеков С. Е., Валерон К., Шнитовска М. Разработка состава и технологии раневых покрытий на основе коллагена // Фармация Казахстана. — 2018. — № 10 — С.28–32
4. Новикова И. В., Антипова Л.В., Романюк Т.И., Бовва О.А., Кудряшова М. С. Разработка технологии напитков типа «Шорли» с коллагеном // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. — 2020. — № 3 (85) — С. 50–57.
5. Кажымурат А. Т., Уажанова Р.У., Ахметсадыков Н. Н., Айдарова М. М., Абдел З. Ж., Тютенов К. С. Перспективы применения коллагена в пищевой промышленности // Сельскохозяйственные науки и агропромышленный комплекс на рубеже веков. — 2017. — С.7–14.
6. Дарвиш Д. М., Кухарева Л. В., Шамолина И.И и др. // Вio technology. Water and foodstuffs- 2008.- С. 247.
7. Патент РФ № 2214827.- Опубл. 27.10.2003.
8. Истранов Л. П., Барамбойм Н. К., Чернов Н.В. // Научные труды МТИЛП. — 1985. — № 33 — С. 20–26.