Исследование антагонистической активности штаммов Trichodermaasperellumк токсинобразующим фитопатогенным грибам рода Fusarium. Для оценки антимикробной активности проводили исследования методами перпендикулярных штрихов, бумажных дисков и агаровых блоков (метод диффузии в агар). Перспективным для штаммов Trichodermaasperellumявляется дальнейшее изучение свойств вторичных метаболитов и разработки антимикробных препаратов.
Ключевые слова:гиперпаразитическая, антагонистическая, антиикробная, токсинобразующие, грибы.
В последние время грибы находят все большее применение в самых разнообразных областях деятельности человека. На данный момент хорошо изучены свойства только незначительного количества известных видов. В связи с этим необходимо как детальное изучение биологии поиск новых полезных свойств других грибов [1].
Одними из естественных антагонистов фитопатогенных микроорганизмов являются грибы рода Trichoderma, обнаруживающие космополитизм и встречающиеся во всех типах почв. Популяции грибов рода Trichoderma являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: условно-патогенных и патогенных бактерий, фитопатогенных грибов, опухолевых клеток, а также оказывающих влияние на рост высших растений. На основе этих грибов создана группа биопрепаратов-триходерминов. Большинство исследователей во всем мире отмечают их высокую эффективность в подавлении многих возбудителей болезней растений. В связи с широким применением грибов рода Trichoderma в самых разных странах накоплен огромный фактический материал, касающийся физиолого-морфологических, биохимических и генетических исследований грибов, а также технологии получения биопрепаратов и их успешное применение. Однако, потенциальные возможности использования представителей вида микромицетовTrichodermaasperellum в биологическом контроле возбудителей инфекций растений изучены недостаточно. По словам ведущего специалиста, занимающегося исследованием этих грибов Г. Самуельса (Samuels, 2006): «Род Trichoderma сейчас в стадии открытия для человечества. Численность, биоразнообразие, роль и взаимодействие видов Trichoderma вокружающей среде только теперь можно оценить в полной мере. С открытием новых экологических ниш и описания новых видов в неизученных географических регионах еще много новых видов будет найдено, изучены процессы жизнедеятельности этого «захватывающего» рода и использован их потенциал в биотехнологии будущего» [2,5,6,7].
Цель работы: исследование антагонистической активности штаммов Trichodermaasperellum к токсинобразующим фитопатогенным грибам рода Fusarium.
Исследования проводили со штаммамиTrichodermaasperellum: T-30 (ВКПМ F-767), TH-7 (ВКПМ F-888) и МГ/6 (ВКПМ F-878), выделенными из различных природных объектов Средней Сибири [5].
1. T-30 (Номер штамма в Генбанке KF900134) — выделен из исходного штамма, изолированного из почвы тепличного комплекса Березовского района Красноярского края.
2. TH-7 (Номер штамма в Генбанке KF922329) — выделен из исходного штамма, изолированного из почв Таловского лесничества Красноярского края.
3. Mg-6 (Номер штамма в Генбанке KF922326) — моноспоровый штамм, выделен из исходного Mg-97, изолированного из почв лесного биоценоза Маганского лесхоза Красноярского края.
В качестве тест-объектов изучали штаммы токсинобразующих видов FusariumsporotrichioidesSherb. (ВКПМ F-890) и FusariumsambucinumFuckel (ВКПМ F-900).
Культуральные фильтраты и мицелия гриба Trichodermaasperellum получали глубинным культивированием на питательной среде Сабуро в течении 10 и 14 суток. Антимикробные соединения исследовали в водных, спиртовых и этилацетатных экстрактах мицелия. Для оценки антимикробной активности исследования проводили методами перпендикулярных штрихов, бумажных дисков и агаровых блоков (метод диффузии в агар) [3,4].
Исследуя культуральные экстракты штамма Trichodermaasperellum методом бумажных дисков и методами диффузии в агар, наиболее эффективные действия проявил этилацетатный экстракт из культуральной жидкости штамма TrichodermaasperellumМГ/6 и Т-30. Этилацтатный экстракт получали глубинным культивированием T. asperellum в колбах на 1000 мл на жидкой среде Сабуро на качалке в течении 10 и 14 суток, затем культуральную жидкость фильтровали через мембранные фильтры на воронке Зейца под вакуумом. Для извлечения антибиотических веществ культуральную жидкость экстрагировали этилацетатом (1:1). Полученные экстракты упаривали в вакууме на роторном испарителе «Rotavapor-RBǘchi» (Швейцария) при 42°С досуха, сухой остаток растворяли в водном 60 % этаноле и получали спиртовые концентраты. Во всех фракциях — маточниках (исходной культуральной жидкости).
Однако, проверяя спиртовые и водные экстракты из штаммов Trichoderma, методом диффузии в агар, выяснили, что спиртовой экстракт активнее, чем водный экстракт по отношению токсинобразующим грибам рода Fusarium. Для получения спиртовых и водных экстрактов грибы глубинно культивировали на жидкой среде Сабуро на качалке (120–140 об/мин) в течении 10 и 14 суток, затем культуральную жидкость фильтровали через мембранные фильтры на воронке Зейца под вакуумом. Отобранный мицелий помещали в морозильную камеру, после оставляли в сушильном шкафу при температуре 40оС до полного испарения влаги.
Водные и спиртовые экстракты из биомассы мицелия получали путем измельченния биомассы и экстрагирования при температуре: 22 ± 1 °С. Соотношение исследуемого образца к экстрагенту составляло 1:3. Из мицелия определяли антимикробную активность методом диффузии в агар. Действие спиртового экстракта наглядно изображено на рисунке 1.
Рис. 1 Метод диффузии в агар со спиртовым экстрактом Trichodermaasperellum на Fusariumsambucinum и Fusariumsporotrichioides. а) T. asperellum МГ/6 и F. sambucinum F-900; б) T. asperellum Т-30 и F. sambucinum F-900; в) T. asperellum TH-7 и F. sambucinum F-900; г) T. asperellum МГ/6 и F. sporotrichioides F-890; д) T. asperellum Т-30 и F. sporotrichioides F-890; е)T. asperellum TH-7 и F. sporotrichioides F-890.
Антагонистическая активность продуцентов родаTrichoderma складывается из двух показателей: гиперпаразитической активности и антибиотической. Как показали исследования большого числа авторов, грибы этого рода образуют большое количество антимикробных соединений, которые выделяются в окружающую среду (при культивировании в культуральную жидкость) или могут накапливаться в мицелии штаммов.
Оценка гиперпаразитической активности показала гетерогенность штаммов в пределах вида и различия по степени активности изолятов в отношении фитопатогенных микромицетов.Штаммы вида Trichodermaasperellum проявили внутривидовую вариабельность по гиперпаразитической активности в зависимости от вида фитопатогена (таб. 1).
Таблица 1
Индекс антагонизма в баллах
|
Исследуемый штамм |
Индекс антагонизма |
|
|
F.sporotrichioides |
F.sambucinum |
|
|
T. asperellum TH-7 |
2 |
4 |
|
T. asperellum T-30 |
4 |
4 |
|
T. asperellum МГ/6 |
5 |
5 |
Для описания типов взаимоотношений между грибами рода Trichoderma и фитопатогенами родов Fusarium использовали шкалу Джонсона и Карла, в модификации и дополнении Ф. К. Алимовой.
Исследуемый штаммTrichodermaasperellum МГ/6 характеризуется максимальной активностью и действует на FusariumsporotrichioidesSherb.(ВКПМ F-890) и Fusarium sambucinum Fuckel (ВКПМ F-900) одинаково по шкале Джонсона и Карла — 5 баллов., т. е. механизм подавления — при контакте антагонист продолжает расти с неизменной скоростью поверх колонии подавляемого организма. Штамм Trichodermaasperellum T-30 действует одинаково на FusariumsporotrichioidesSherb.(ВКПМ F-890) и Fusarium sambucinum Fuckel (ВКПМ F-900). Индекс антагонизма по шкале Джонсона и Карла составляет 4 балла, т. е. подавление одного организма при контакте, антагонист обрастает колонию подавляемого организма. Для Trichodermaasperellum TH7 в отношении обоих видов Fusariumхарактерна низкая гиперпаразитическая активность, индекс антагонизма составил 4 и 2 балла соответственно.
В результате проведенных исследований были получены следующие результаты: Микромицеты рода TrichodermaasperellumМГ/6, T-30 и TH-7 проявляют антибиотическую активность по отношению к токсинобразующим штаммамFusariumsambucinumиFusariumsporotrichioides. Из трех представленных штаммов грибов T. asperellumвысокую антоганистическую активность в отношении фитопатогенов рода Fusarium проявляют штаммы Trichodermaasperellum МГ/6 и Т-30.
Вывод
Грибы рода Trichodermaявляются природным резервуаром биологически активных соединений эффективных для контроля фитопатогенных грибов. Стабильность культурально-морфологических признаков является критерием отбора штаммов — продуцентов для получения целевых продуктов в биотехнологии.
Все штаммы рекомендуется использовать в виде спорово-мицелиального препарата, так как только такая форма обеспечивает подавление сразу двух видов фитопатогенов — FusariumsambucinumиFusariumsporotrichioides. Таким образом, на основе штаммов T. аsperellum МГ/6 и Т-30 рекомендуется получениебиопрепаратов.
Литература:
1. Александрова А. В. Грибы рода Trichoderma Pers.: FR.: Таксономия, географическое распространение и экологические особенности: диссертация... кандидата биологических наук: 03.00.24.- Москва, 2000.- 221 с.: ил. РГБ ОД, 61 01–3/778–3
2. Аспите, А. Ф. Использование триходермина для защиты растений от фитопатогенных микромицетов / Аспите А. Ф., Швинка Ю. Э., Стрикаускас С. В. // Вестник с.-х. науки. — 1981. — № 9. — С. 114–118.
3. Егоров Н. С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности// Издательство «Высшая школа», Москва, 1965, с — 96–130
4. Егоров Н. С. Основные учения об антибиотиках// Изд.МГУ, Наука, Москва 2004г. — с 78
5. Садыкова В. С. Экология грибов рода Trichoderma (Pers.:Fr.) бассейна реки Енисей, их биологические свойства и практическое использование: Автореф. док. биол. наук / Садыкова В. С. — Москва, 2012. — С.8–31
6. Chet I. Trichoderma — application, mode of action, and potential as a biocontrol agent of soilborne plant pathogenic fungi / Chet I. // In Innovative Approaches to Plant Disease Control (ed. I. Chet). — 1987. — P. 137–160.
7. Reino, J. L. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma / J. L. Reino, R. F. Guerriero, R. Herna'ndez-Gala', I. G. Collado // Phytochem Rev. 2008. — Vol. 7. — P. 89–123.
