Естественные киллеры (ЕК) являются клетками врожденного иммунитета, отвечающими за противоопухолевый и противовирусный иммунитет. В ходе некоторых экспериментов отмечалось увеличение количества ЕК в легочных альвеолах мышей на ранних стадиях инфицирования M. tuberculosis. Повышение цитотоксичности ЕК с помощью модификаторов биологических реакций является одним из приоритетных направлений в иммунологии. Успехи в данной области позволят в перспективе снизить заболеваемость туберкулезом легких благодаря увеличению их цитотоксичности.
Ключевые слова: мононуклеары периферической крови, естественные киллеры, туберкулез легких, модификаторы биологических реакций, сукцинат, «Реамберин»©.
Туберкулез — инфекционное заболевание, вызываемое различными видами микобактерий (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis иM. africanum), с преимущественным поражением легких. Наибольший вклад в противотуберкулезный иммунитет вносят клеточные реакции с участием Т-хелперов, Т-киллеров и естественных киллеров, продуцирующих интерлейкин-2, хемокины и гамма-интерферон [3]. Т-хелперы специфически сенсибилизируются к микобактериальным антигенам, активируют фагоцитозную и бактериоцидную активность макрофагов. Т-киллеры способны оказывать прямое цитотоксическое действие на клетки, инфицированные микобактериями [2]. С помощью данных клеток изначально повышается бактерицидный потенциал макрофагов, а фагоцитоз приобретает завершенный характер. Особенно важна роль естественных киллеров на начальных этапах развития противотуберкулезного иммунитета, поскольку они способны немедленно разрушать инфицированные клетки и стимулировать развитие клеточного иммунного ответа. В экспериментальных работах по изучению противотуберкулезного иммунитета на мышах было описано повышение количества популяции естественных киллеров (ЕК) в легких животных в первые 3 недели после инфицирования.
Естественные киллеры — это клетки врожденного иммунитета, обладающие противоопухолевым и противовирусным иммунитетом, а также способные уничтожать клетки, инфицированные микроорганизмами (бактериями, простейшими и т. д.) путем выделения белков перфоринов и гранзимов, запускающих цикл реакций каспаз, приводящих клетку к апоптозу. Естественные киллеры в большом количестве выделяют цитокин гамма-интереферон, который способствует активации клеточного иммунитета. ЕК-клетки играют большую роль на ранних этапах инфицирования и запуска противотуберкулезного иммунитета [4].
При распространенных формах туберкулеза выявляется дефект антиген-специфического Т-клеточного ответа. Это проявляется в угнетении пролиферации периферических Т-лимфоцитов, снижении содержания Т-клеток. Это предопределяет развитие регуляторной, а при углублении патологического процесса — и структурно-функциональной вторичной иммунной недостаточности клеточного типа [2]. Поэтому единственными клетками, повышающими бактерицидный потенциал макрофагов на данной стадии заболевания, остаются естественные киллеры.
Цель исследования — изучение цитотоксического действия естественных киллеров крови здоровых доноров и пациентов, страдающих туберкулезом легких, после активации препаратом «Реамберин»©, содержащего сукцинат, в разных концентрациях.
Актуальность настоящего исследования обусловлена увеличением количества населения, инфицированного микобактериями туберкулеза, а также пациентов, имеющих диагноз туберкулез легких. Поиск природных модификаторов биологических реакций позволит повысить цитотоксичность естественных киллеров на ранних стадиях инфицирования и предотвратить развитие заболевания у пациентов.
Материал и методы.
В качестве объектов исследования использовали по 4 мл венозной крови от пяти практически здоровых доноров мужского пола первого периода зрелого возраста (контрольная группа) и по 4 мл венозной крови от пяти пациентов мужского пола, больных туберкулезом, первого периода зрелого возраста (опытная группа).
Методами исследования являлись культивирование, градиентное центрифугирование и световая микроскопия.
Цельная кровь практически здоровых доноров и пациентов, страдающих туберкулезом легких, была стабилизирована гепарином (20 ЕД/мл). Культивирование проводилось в стерильных пластиковых пробирках по 10 мл. Моделирование острого системного воспаления in vitro осуществлялось добавлением в культуральную среду вакцины БЦЖ. При этом добивались соотношения МПК: M. bovis = 1:5. В кровь добавляли препарат «Реамберин»© (1,5 %-400 мл), содержащий сукцинат, в трех концентрациях: 3 мг/мл, 5 мг/мл, 7,5 мг/мл. Кровь культивировали в течение 48 часов в CO2-инкубаторе при 36,6°С.
Через 48 часов мононуклеары периферической крови (МПК) здоровых доноров и пациентов, страдающих туберкулезом легких, выделяли методом градиентного центрифугирования [1]. Для этого 6 мл смеси наслаивали на 1,5 мл раствора фиколла (ρ=1,077 г/см3), трижды центрифугировали и отмывали. МПК подсчитывали в камере Горяева. Опухолевые клетки линии К-562 пересевали дважды в неделю. Их отмывали питательной бикарбонатной средой, подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность мононуклеаров периферической крови и опухолевой линии К-562 составила более 96 %.
Иммунологическое исследование проводилось в плоскодонном иммунологическом планшете Terasaki. Одновременно на планшете проводились 4 серии экспериментов по 3 разведения с 3 повторами. Активность естественных киллеров определяли в краткосрочных (4-х часовых) тестах при соотношении эффектор-мишень 1:1, 1:10 и 1:100. Учёт теста проводили микроскопически путём подсчёта погибших клеток К-562 методом исключения красителя трипанового синего. Всего в ходе исследования было подсчитано 360 лунок.
Результаты и их обсуждение.
Ниже представлены графики с процентом гибели клеток опухоли К-562 под действием естественных киллеров в четырех сериях экспериментов в трех разведениях крови здоровых доноров (рис. 1) и пациентов, страдающих туберкулезом легких (рис. 2).
Рис. 1. Результаты цитотоксического теста здоровых доноров (средние значения по 5 донорам)
Рис. 2. Результаты цитотоксического теста пациентов, страдающих туберкулезом легких (средние значения по 5 пациентам)
В каждой из серии экспериментов был рассчитан процент гибели клеток опухоли К-562, а также проведен статистический анализ с подсчетом среднего значения, минимума, максимума, стандартного отклонения, стандартной ошибки. Процент гибели К-562 в контроле (МПК пациентов, страдающих туберкулезом легких + K-562 + M. bovis) был 4,1±0,5 % (1/1), 7,3±0,2 % (1/10) и 14,2±0,6 % (1/100). Процент гибели К-562 в контроле (МПК здоровых доноров + K-562 + M. bovis) был 5,5±0,9 % (1/1), 9,7±1,7 % (1/10) и 18,9±4,2 % (1/100). «Реамберин»© в концентрации 3 мг/мл: процент гибели К-562 (МПК пациентов + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 6,0±0,2 % (1/1), 7,9±0,3 % (1/10) и 17,9±0,6 % (1/100); процент гибели К-562 (МПК доноров + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 8,5±2,4 % (1/1), 11,6±2,3 % (1/10) и 22,5±5,1 % (1/100). «Реамберин»© в концентрации 5 мг/мл: процент гибели К-562 (МПК пациентов + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 6,2 ±0,3 % (1/1), 12,5±0,2 % (1/10) и 18,2±0,4 % (1/100); процент гибели К-562 (МПК доноров + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 8,8±1,7 % (1/1), 15,9±3,7 % (1/10) и 23,6±5,9 % (1/100). «Реамберин»© в концентрации 7,5 мг/мл: процент гибели К-562 (МПК пациентов + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 6,6±0,4 % (1/1), 13,1±0,3 % (1/10) и 17,7±0,6 % (1/100); процент гибели К-562 (МПК доноров + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 9,4±1,8 % (1/1), 16,4±3,9 % (1/10) и 21,6±5,3 % (1/100).
Заключение.
Вакцина БЦЖ способствует активации цитотоксичности естественных киллеров, сукцинат является метаболическим стимулятором их активности. Наибольшая цитотоксичность естественных киллеров отмечается в разведении 1:100. Оптимальная концентрация препарата «Реамберин»© — 5 мг/мл — что соответствует рекомендуемой концентрации препарата для внутривенного введения. У пациентов с туберкулезом легких цитотоксичность естественных киллеров ниже, чем в контрольной группе здоровых доноров. Отмечается тенденция к увеличению цитотоксичности при увеличении разведения клеток-мишеней и клеток-эффекторов, а также при увеличении концентрации препарата «Реамберин»©.
Литература:
1. Клаус, Дж. Лимфоциты: Методы. / Дж. Клаус. — М.: Мир, 1990. — С. 30–31.
2. Морозкина, Н. С. Иммунодиагностика туберкулеза: Метод. рекомендации / Н. С. Морозкина, Н. С. Шпаковская. — Мн.: БГМУ, 2003. — 15 с.
3. Перельман, М. И. Фтизиатрия: Учебник для студентов медицинских вузов / М. И. Перельман, В. А. Корякин. — М., 1996.
4. Lotze, Michael T. Natural Killer Cells: Basic Science and Clinical Application. / Michael T. Lotze, Angus W. Thomson. — London: Elsevier, 2010. — 678 p.
