В процессе атерогенеза разные клеточные популяции взаимодействуют друг с другом и с межклеточным веществом [1,2], поэтому результаты, полученные в экспериментах с клеточными монокультурами, не всегда можно экстраполировать на целостный организм [3]. Серия публикаций по измерению атерогенности крови в клеточных культурах приобрела мировую известность и продолжается уже более двух десятилетий [4–35]. Культуры гладкомышечных клеток или макрофагов использовались в качестве модели для определения атерогеноости сыворотки, оценки про- и антиатерогенного действия различных веществ. Культивирование клеток с разбавленной (40 %) сывороткой от больных атеросклерозом сопровождалось увеличением содержания внутриклеточного холестерина в 2–5 раз [4]. Добавление к клеточным культурам липопротеидов низкой плотности (ЛНП) от больных атеросклерозом приводило к повышению содержания холестерина в цитоплазме культивируемых моноцитов крови и гладкомышечных клеток в 2–4 раза [5,6]. Культивирование клеток с сывороткой или ЛНП от здоровых лиц не сопровождалось подобным эффектом [4,5]. Антагонисты кальция (верапамил и др.) уменьшали содержание холестерина в культивируемых клетках и одновременно снижали инкорпорацию клетками 3H-тимидина, что расценивалось как признак снижения их пролиферативной активности [7]. Напротив, бета-адреноблокаторы вызывали повышение содержания холестерина в культивируемых клетках в 1,5–2 раза и стимулировали клеточную пролиферацию [7]. Подобные эффекты различных веществ в клеточных культурах расценивались как их антиатеросклеротические или, напротив, атерогенные свойства [8]. Помимо добавления тестируемых веществ непосредственно к клеточным культурам, использовалась модель ex vivo: например, после приема бета-адреноблокатора (пропранолол) кровь становилась атерогенной, то есть, стимулировала накопление внутриклеточного холестерина и пролиферацию клеток в культуре [7]. Интересно, что накопление липидов в цитоплазме клеток сопровождалось усилением их пролиферации: например, в культурах гладкомышечных клеток из зон липидной инфильтрации интимы тимидиновый индекс превосходил нормальное значение в 4,5 раза [9]. В экспериментах с клеточными культурами один и тот же фактор одновременно стимулировал накопление липидов клетками и их пролиферативную активность [4,6,8,10]. Следует отметить, что накопление липидов в цитоплазме клеток расценивается в общей патологии как признак дегенерации (дистрофии), которая обычно не сопровождается повышением пролиферативной активности.
На основе экспериментов с клеточными культурами были сформулированы практические рекомендации: для снижения атерогенного потенциала крови и поддержания его на низком уровне было рекомендовано назначение препарата верапамил в дозе 40 мг по 5 раз в день с интервалами 4–5 часов [11]. Эту рекомендацию следует рассматривать в рамках более широкого вопроса о допустимости расчета доз только на основе экспериментов in vitro. Клеточные системы имеют большое значение в химико-фармакологических исследованиях, однако их роль в предсказании реакций макроорганизма ограничена. Реакция клеточной системы на фактор, влияющий на трансмембранный транспорт, может существенно отличаться от реакции макроорганизма [3]. В качестве объяснения феномена атерогенности крови обсуждалась роль содержащих холестерин иммунных комплексов [12,13]. Однако известно, что механизм атерогенеза с участием иммунных комплексов включает действие медиаторов воспаления: цитокинов, адгезивных молекул, а также дисфункцию эндотелиальных клеток. Эти явления не воспроизводятся в клеточных монокультурах. В других публикациях атерогенные свойства сыворотки больных атеросклерозом объясняли различными модификациями ЛНП: оксидацией [14], десиалированием [15–19], отрицательным электрическим зарядом [20], необратимой ассоциацией [21], конформационной модификацией [22] и др. В противоположность нативным ЛНП, добавление модифицированных ЛНП к клеточным культурам сопровождалось накоплением холестерина в клетках [17]. Не отрицая возможности атерогенного действия модифицированных ЛНП, необходимо отметить, что модификации ЛНП сами по себе не объясняют «атерогенных» свойств сыворотки в культурах. Например, сообщалось, что ЛНП с отрицательным электрическим зарядом способствуют выделению эндотелием воспалительных медиаторов, что может способствовать атерогенезу, тогда как ЛНП с низким содержанием сиаловой кислоты более эффективно связывались с протеогликанами межклеточного матрикса [36,37]. Эндотелий и межклеточный матрикс отсутствуют в клеточной культуре.
Были выявлены количественные закономерности: статистически достоверные корреляции между атерогенностью сыворотки и «утолщением интимы-медии общих сонных артерий» [23], между спонтанным повышением атерогенности сыворотки и прогрессированием атеросклероза (P=0.008). В то же время, устранение атерогенности сыворотки под действием терапии сопровождалось обратным развитием атеросклероза (P=0.014)» [23]. Однако, как обсуждалось ранее [38–40], корреляция между атерогенностью сыворотки в культуре клеток и атерогенезом in vivo должна быть скорее обратной, чем прямой. Например, при семейной гипрехолестеринемии, обусловленной аномалией рецепторов к липопротеидам, неэффективный клиренс ЛНП-холестерина из крови предрасполагает к развитию атеросклероза [41]. Рецепторы к липопротеидам имеются на макрофагах и гладкомышечных клетках [42–44]. Концентрация в крови связанных с холестерином липопротеидов в значительной степени зависит от функционирования ЛНП-рецепторов. Предполагается, что культивируемые клетки поглощают холестерин, главным образом, посредством рецепторного механизма [45]. Соответственно, если некий фактор подавляет поглощение клетками холестерина in vitro, можно ожидать, что он будет повышать уровень холестерина крови in vivo. Гиперхолестеринемия, в свою очередь, запускает механизмы атерогенеза [46].
Несмотря на дискуссии на конференциях, авторы обсуждаемой серии исследований не цитируют опубликованную критику [38–40]. Однако в недавней статье имеется следующий пассаж, который можно рассматривать как ответ на приведенную выше аргументацию: «Все типы атерогенных модификаций ЛНП характеризуются формированием липопротеидных само-агрегатов (self-associates) [24]… Ассоциация липопротеидов — это основное условие внутриклеточного накопления липидов, обусловленного модифицированными ЛНП. Захват клетками таких крупных частиц как агрегаты ЛНП осуществляется в обход путей, регулируемых рецепторами» [25]. Приведенная цитата подкреплена одной ссылкой на собственную публикацию [24]. Следует отметить, что агрегация ЛНП играет роль в атерогенезе, однако предполагается, что центральным звеном этого процесса является субэндотелиальное отложение ЛНП в межклеточном матриксе [47,48]. Эндотелий и межклеточный матрикс отсутствуют в клеточных культурах. Кроме того, это утверждение противоречит сведениям из более ранней публикации с участием тех же авторов, согласно которым частицы ЛНП с более низким содержанием нейтральных сахаров и сиаловой кислоты были по размеру меньше, чем частицы богатых этими веществами ЛНП [26]. В той же [26] и других [15–19] публикациях говорится о более высокой атерогенности десиалированных ЛНП. В статье тех же авторов [18] говорится, что атерогенные десиалированные ЛНП взаимодействуют как с нативными рецепторами к ЛНП, так и с рецепторами-мусорщиками (scavenger) макрофагов и эндотелиальных клеток. Рецепторы обоих типов найдены также на гладкомышечных клетках [43,44]. В той же статье отмечалось, что агрегация ЛНП не играла роли в данном эксперименте с оценкой атерогенности в клеточной культуре, в частности, при взаимодействии ЛНП с рецепторами-мусорщиками [18]. В связи с этим невозможно также обойти вопрос достоверности. В литературе отмечаются расхождения некоторых данных Орехова и соавт. [27–29] с данными литературы, что объясняют артефактами [49]. Более того, вызывают сомнение полученные в клеточных культурах данные о статистически достоверном антиатерогенном действии чая, грибов, рыбных консервов [30–33], хвои сосны (экстракт которой в 3 раза снижал атерогенность сыворотки), проростков пшеницы и т. п. [34], а также рассчитанные на основании экспериментов с клеточными культурами дозировки лекарств [11] и другие практические рекомендации [8]. С учетом изложенного, авторам следует рекомендовать сделать ретроспективный обзор своих публикаций и произвести ретракцию тех из них, результаты которых по тем или иным причинам вызывают сомнения. Однако в недавно опубликованном обзоре собственных публикаций [35] самокритика отсутствует. Нигде не упоминается также о конфликтах интересов, хотя авторы участвовали в производстве биологически активных добавок (БАД) и лекарственных препаратов [35], об эффективности которых речь идет в их же научных статьях. «ИНАТ-Фарма — производственно-коммерческая фирма, основанная в 1996 г., специализируется на выпуске биологически активных добавок, разработанных НИИ атеросклероза РАЕН, предназначенных для профилактики сердечно-сосудистых, онкологических и других заболеваний» [50]. Большинство цитированных в этой статье работ выполнено сотрудниками НИИ атеросклероза РАЕН. Очевидно, что коммерческая деятельность наряду с государственным финансированием (грант 14–15–00112 Российского фонда фундаментальный исследований) [25] дает средства для участия в международных конгрессах и публикации в зарубежных платных изданиях [35], что, в свою очередь, помогает в деле регистрации БАД и лекарственных препаратов.
Основываясь на своей концепции атерогенности сыворотки и ее измерения в клеточных культурах, исследователи перешли к использованию плазмафереза (экстракорпоральной перфузии крови больных через колонку с иммобилизованными ЛНП в течение 2 часов) с целью «удаления нелипидного фактора (факторов) атерогенности» [25]. Процедуру проводили дважды в месяц в течение 7–9 месяцев у пациентов со стенокардией, ангиографически документированным стенозом 2–3 коронарных артерий и нормальным уровнем холестерина крови. Сообщалось об улучшении самочувствия пациентов и повышении переносимости ими физической нагрузки [25], что могло быть обусловлено эффектом плацебо [51]. Плазмферез связан с рисками, хотя тяжелые осложнения очень редки [52–54]. В особенности, плазмаферез сопровождается риском гемодинамических осложнений у пациентов с одновременным атеросклеротическим поражением разных артериальных бассейнов, когда может отсутствовать адекватная реакция на гемоэксфузию [54]. Нужно также отметить, что аферез как всякая инвазивная процедура требует информированного согласия, причем пациенты должны быть объективно информированы о возможных эффектах и рисках [55]. В данном случае нельзя a priori отрицать эффективность плазмафереза, хотя при атеросклерозе эта процедура обычно направлена на снижение уровня липопротеидов и холестерина крови у больных резистентной, в особенности, семейной гиперхолестеринемией [46,56–58].
Качество исследований и возможные конфликты интересов должны учитываться при включении публикаций в обзоры и мета-анализ, а также при предоставлении грантов. К сожалению, во многих журналах на русском языке не принято публиковать декларации об отсутствии или наличии конфликта интересов. Сомнительные данные, теории и соответствующие публикации могут прямо или косвенно использоваться в целях регистрации и рекламы БАД, лекарственных препаратов и методов лечения с недоказанной эффективностью. Некоторые обсуждаемые в этой статье вопросы не выяснены окончательно, а приведенные аргументы могут вызвать дискуссию. В этой связи важно подчеркнуть необходимость соблюдения правил научной полемики, ибо только тогда дискуссия будет способствовать достижению истины. В соответствии с нормами научной полемики, отказ отвечать на аргументы критического характера равносилен отказу от доказываемого тезиса. На приведенную выше аргументацию можно возразить, что, если БАД и лекарственные препараты с недоказанным эффектом не будут производить в России, их место займет столь же сомнительная импортная продукция. Ответ может быть только один: объективный научный подход к отечественным и импортным препаратам со стороны регистрирующих и надзорных инстанций в интересах здравоохранения, противодействие дезинформации в медицинской рекламе и профессиональной литературе.
Рис. 1. Сайт НИИ атеросклероза РАЕН (2007 г.)
Рис. 2. Сайт НИИ атеросклероза РАЕН со списком зарегистрированных БАД. Видна ссылка на сайт фирмы ИНАТ-Фарма (2007 г.)
Литература:
1. Gebbers J. O. Atherosclerosis, cholesterol, nutrition, and statins — a critical review. GMS Ger Med Sci 2007; 5: Doc04.
2. Mundo-Sagardía J.A, Figueroa Y., Altieri P. I., et al. The atherosclerotic plaque. P R Health Sci J 2008;27:241–246.
3. Escobales N. Testing of anti-atherogenic drugs and food components on cell cultures: assessment of reliability. Author’s reply. P R Health Sci J 2010;29:87.
4. Orekhov A. N., Tertov V. V., Pokrovsky S. N., et al. Blood serum atherogenicity associated with coronary atherosclerosis. Evidence for nonlipid factor providing atherogenicity of low-density lipoproteins and an approach to its elimination. Circ Res 1988;62:421–429.
5. Tertov V. V., Orekhov A. N., Sobenin I. A., et al. Three types of naturally occurring modified lipoproteins induce intracellular lipid accumulation due to lipoprotein aggregation. Circ Res 1992;71:218–228.
6. Tertov V. V., Orekhov A. N., Martsenyuk O. N., et al. Low-density lipoproteins isolated from the blood of patients with coronary heart disease induce the accumulation of lipids in human aortic cells. Exp Mol Pathol 1989;50:337–347.
7. Orekhov A. N., Baldenkov G. N., Tertov V. V., et al. Cardiovascular drugs and atherosclerosis: effects of calcium antagonists, beta-blockers, and nitrates on atherosclerotic characteristics of human aortic cells. J Cardiovasc Pharmacol 1988;12 Suppl 6:S66–68.
8. Ли Хва Рен, Васильев АВ, Орехов АН, Тертов ВВ, Тутельян ВА. Антиатеросклеротические и атерогенные свойства некоторых природных соединений и бета-адреноблокаторов. Хим. Фарм. журнал 1989;(9):1106–8.
9. Orekhov A. N., Kosykh V. A., Repin V. S., Smirnov V. N. Cell proliferation in normal and atherosclerotic human aorta. II. Autoradiographic observation on deoxyribonucleic acid synthesis in primary cell culture. Lab Invest 1983;48:749–754.
10. Orekhov A. N., Tertov V. V., Kudryashov S. A., et al. Primary culture of human aortic intima cells as a model for testing antiatherosclerotic drugs. Effects of cyclic AMP, prostaglandins, calcium antagonists, antioxidants, and lipid-lowering agents. Atherosclerosis 1986;60:101–10.
11. Orekhov A. N., Pivovarova E. M., Sobenin I. A., et al. Use of cell culture for optimisation of direct antiatherogenic therapy with verapamil. Drugs 1992;44 Suppl 1:105–110.
12. Tertov V. V., Orekhov A. N., Sayadyan K. S., et al. Correlation between cholesterol content in circulating immune complexes and atherogenic properties of CHD patients' serum manifested in cell culture. Atherosclerosis 1990;81:183–9.
13. Каленич ОС, Тертов ВВ, Новиков ИД, и соавт. Холестерин циркулирующих иммунных комплексов как биохимический маркер коронарного атеросклероза. Кардиология 1991;(2):42–4.
14. Panasenko O. M., Mel'nichenko A. A., Aksenov D. V., et al. Oxidation-induced aggregation of LDL increases their uptake by smooth muscle cells from human aorta. Bull Exp Biol Med 2007;143:200–203.
15. Sobenin I. A., Chistiakov DA, Bobryshev YV, Orekhov A. N. Blood atherogenicity as a target for anti-atherosclerotic therapy. Curr Pharm Des 2013;19:5954–5962.
16. Tertov V. V., Kaplun V. V., Sobenin I. A., et al. Human plasma trans-sialidase causes atherogenic modification of low density lipoprotein. Atherosclerosis 2001;159:103–15.
17. Tertov V. V., Kaplun V. V., Sobenin I. A., Orekhov A. N. Low-density lipoprotein modification occurring in human plasma possible mechanism of in vivo lipoprotein desialylation as a primary step of atherogenic modification. Atherosclerosis 1998;138:183–95.
18. Orekhov AN, Tertov VV, Sobenin IA., et al. Sialic acid content of human low density lipoproteins affects their interaction with cell receptors and intracellular lipid accumulation. J Lipid Res. 1992;33(6):805–17.
19. Мухин ДН, Тертов ВВ, Качарава АГ, Орехов АН. Десиалированные липопротеиды низкой плотности — атерогенные липопротеиды, обнаруженные в крови больных коронарным атеросклерозом. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1990;60(8):138–40.
20. Tertov V. V., Sobenin I. A., Kaplun V. V., Orekhov A. N. Antioxidant content in low density lipoprotein and lipoprotein oxidation in vivo and in vitro. Free Radic Res 1998;29:165–73.
21. Suprun IV, Mel'nichenko AA, Sobenin I. A., et al. Resistance of native and circulating modified low-density lipoproteins in human blood to association. Bull Exp Biol Med 2004;138:380–3.
22. Suprun I. V., Mel'nichenko A. A., Yanushevskaya E. V., et al. Antigenic differences between apo-B in native and circulating modified low-density lipoproteins. Bull Exp Biol Med 2004;138:42–44.
23. Orekhov A. N., Sobenin I. A. Serum atherogenicity predicts the progression of atherosclerosis. Abstracts of the XIV International Symposium on Atherosclerosis; 2006 June 18–22; Rome, Italy. Atherosclerosis Suppl 2006;7(3):209.
24. Tertov VV, Sobenin IA, Gabbasov ZA., et al. Lipoprotein aggregation as an essential condition of intracellular lipid accumulation caused by modified low density lipoproteins. Biochem Biophys Res Commun. 1989;163(1):489–94.
25. Orekhov A. N., Melnichenko A. A., Sobenin I. A. Approach to reduction of blood atherogenicity. Oxid Med Cell Longev 2014;2014:738679.
26. Tertov VV, Orekhov AN, Sobenin IA., et al. Carbohydrate composition of protein and lipid components in sialic acid-rich and -poor low density lipoproteins from subjects with and without coronary artery disease. J Lipid Res. 1993;34(3):365–75.
27. Orekhov AN, Tertov VV, Mukhin DN, Mikhailenko IA. Modification of low density lipoprotein by desialylation causes lipid accumulation in cultured cells: discovery of desialylated lipoprotein with altered cellular metabolism in the blood of atherosclerotic patients. Biochem Biophys Res Commun. 1989;162:206–11.
28. Orekhov AN, Tertov VV, Mukhin DN. Desialylated low density lipoprotein: naturally occurring modified lipoprotein with atherogenic potency. Atherosclerosis. 1991;86:153–161.
29. Tertov VV, Sobenin IA, Tonevitsky AG., et al. Isolation of atherogenic modified (desialylated) low density lipoprotein from blood of atherosclerotic patients: separation from native lipoprotein by affinity chromatography. Biochem Biophys Res Commun. 1990;167:1122–27.
30. Васильев АВ, Ли Хва Рен, Орехов АН, и соавт. Антиатеросклеротические свойства некоторых компонентов чая. Хим. Фарм. журнал 1989;(9):1108–10.
31. Верткин АЛ, Ли ЕД, Пышкина ИА, и соавт. Роль рыбных пищевых добавок в лечении и профилактике атерогенной дислипидемии. Кардиология 1994;(8):22–8.
32. Ryong L. H., Tertov V. V., Vasil'ev A. V., et al. Antiatherogenic and antiatherosclerotic effects of mushroom extracts revealed in human aortic intima cell culture. Drug Dev Res 1989;17:109–17.
33. Ли Хва Рен, Васильев А. В., Орехов А. Н. и др. Анти-атеросклеротические свойства высших грибов (клинико-экспериментальное исследование). Вопр. питания 1989;(1):16–19.
34. Собенин И. А. Принципы патогенетической терапии атеросклероза. Использование клеточных моделей. Автореферат дисс. д.м.н. Науч.-исслед. ин-т общ. патологии и патофизиологии РАМН, Москва, 2006–48 с.
35. Orekhov AN. Anti-atherosclerotic drugs from natural products. Nat Prod Chem Res. 2013;1:121.
36. Sánchez-Quesada J. L., Camacho M., Antón R., et al. Electronegative LDL of FH subjects: chemical characterization and induction of chemokine release from human endothelial cells. Atherosclerosis 2003;166:261–70.
37. Camejo G., López A., López F., et al. Interaction of low density lipoproteins with arterial proteoglycans. The role of charge and sialic acid content. Atherosclerosis 1985;55:93–105.
38. Яргин С. В. Испытания атерогенности лекарственных препаратов и пищевых добавок на культуре клеток: оценка достоверности результатов. Кардиология 2009;49(5):75–6.
39. Jargin SV. Testing of serum atherogenicity on cell cultures: assessment of reliability. Gazz Med Ital 2011;170(2):159–63.
40. Jargin S. V. Phytoestrogens and other botanicals: on the problems of evidence-based evaluation. Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2013;8:67–71.
41. Marais A. D. Familial hypercholesterolaemia. Clin Biochem Rev 2004;25:49–68.
42. Hiltunen TP, Ylä-Herttuala S. Expression of lipoprotein receptors in atherosclerotic lesions. Atherosclerosis. 1998;137 Suppl:S81–88.
43. Ricciarelli R, Zingg JM, Azzi A. Vitamin E reduces the uptake of oxidized LDL by inhibiting CD36 scavenger receptor expression in cultured aortic smooth muscle cells. Circulation. 2000;102(1):82–7.
44. Llorente-Cortés V, Badimon L. LDL receptor-related protein and the vascular wall: implications for atherothrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(3):497–504.
45. Goldstein J. L., Brown M. S. Progress in understanding the LDL receptor and HMG-CoA reductase, two membrane proteins that regulate the plasma cholesterol. J Lipid Res 1984;25:1450–1461.
46. Кухарчук В. В., Титов В. Н. Атеросклероз и дислипидемии. В кн.: Руководство по кардиологии (ред. Е. И. Чазов). Москва: Практика, 2014, том 3, стр. 15–58.
47. Guarino AJ, Tulenko TN, Wrenn SP. Sphingomyelinase-to-LDL molar ratio determines low density lipoprotein aggregation size: biological significance. Chem Phys Lipids. 2006;142(1–2):33–42.
48. Walters MJ, Wrenn SP. Mechanistic roles of lipoprotein lipase and sphingomyelinase in low density lipoprotein aggregation. J Colloid Interface Sci. 2011;363(1):268–74.
49. Chappey B, Beyssen B, Foos E., et al. Sialic acid content of LDL in coronary artery disease: no evidence of desialylation in subjects with coronary stenosis and increased levels in subjects with extensive atherosclerosis and acute myocardial infarction: relation between desialylation and in vitro peroxidation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998;18(6):876–83.
50. Сайт ИНАТ-Фарма http://ifarm.ru/ (15.10.2014).
51. Воробьев ПА. Биологические эффекты и терапевтические механизмы плазмафереза. В кн: Очерки по производственной и клинической трансфузиологии. Под ред. А. И. Воробьева. Москва, Ньюдиамед, 2006; стр. 511–524.
52. Gilliss B. M., Looney M. R., Gropper M. A. Reducing noninfectious risks of blood transfusion. Anesthesiology 2011;115:635–649.
53. Bambauer R., Schiel R., Latza R. Low-density lipoprotein apheresis: an overview. Ther Apher Dial 2003;7:382–390.
54. Константинов БА, Рагимов АА, Дадвани СА. Трансфузиология в хирургии. Москва: Аир-Арт, 2000; стр. 300–370.
55. Rollins J. Plasmapheresis: population, parameters, standards. In: Therapeutic apheresis and plasma perfusion.Proceedings of the Third National Conference on Therapeutic Apheresis, Dallas, Texas, May 13–15, 1982. Progr Clin Biol Res 1982;106:397–402.
56. Parhofer K. G. How will new medications affect the lipoprotein apheresis situation in Germany? Atheroscler Suppl. 2013;14:71–72.
57. Julius U. Updates in apheresis and atherosclerotic research. Ther Apher Dial 2013;17(2):124.
58. Коновалов ГА, Калинин НН. Плазмаферез. В кн: Очерки по производственной и клинической трансфузиологии. Под ред. А. И. Воробьева. Москва, Ньюдиамед, 2006; стр. 493–510.
