Влияние ацетилсалицилата кобальта на электрическую активность нейронов ППа1 и ППа2 моллюска Helix albescens Rossm

В статье представлены результаты исследований влияния ацетилсалицилата кобальта в концентрациях 5∙10^–5, 5∙10^–4 и 5∙10^–3 М на электрическую активность нейронов ППа1 и ППa2 моллюска Helix albescens Rossm. Показано, что это вещество оказывает активирующий эффект на частоту генерации электрических потенциалов исследуемых нейронов. Полученные данные позволяют рекомендовать ацетилсалицилат кобальта к испытанию в качестве средства, стимулирующего нервную систему.

Ключевые слова: ацетилсалицилат кобальта, электрическая активность, нейроны моллюска.

The article presents results of research of the influence of cobalt acetylsalicylate in concentrations 5∙10^–5, 5∙10^–4 and 5∙10^–3 М on the electrical activity of mollusk neurons RPa1 and RPa2 Helix albescens Rossm. It was shown that in these concentrations this substance had activation effect on frequency electrical potentials of these neurons. These data were allowed us to recommend cobalt acetylsalicylate for testing as a means of stimulating the nervous system.

Key words: cobalt acetylsalicylate, electrical activity, neurons of mollusk.

Введение. Известно [2, с. 310], что ацетилсалициловая кислота оказывает дозозависимое угнетающее действие на электрические потенциалы нейронов моллюска Helix albescens Rossm., использующихся в модельных нейрофизиологических и нейрофармакологических исследованиях [4, с. 46–54]. На её основе в Таврической академии Крымского федерального университета им. В. И. Вернадского было синтезировано новое координационное соединение — ацетилсалицилат кобальта (АСК), обладающее антидепрессантными [14, р. 1041–1045] и антиноцицептивными [3, с. 28–31] эффектами в различных дозах. Поэтому с высокой степенью вероятности можно предполагать наличие у АСК и нейротропной активности.

Цель работы. Изучить влияние АСК на электрическую активность идентифицированных нейронов ППа1 и ППа2 моллюска Helix albescens Rossm.

Материал и методы. Эксперименты выполнены на 78 нейронах ППа1 и ППа2 Helix albescens Rossm. Из тела моллюска извлекали окологлоточное нервное кольцо и фиксировали его вольфрамовыми иглами в экспериментальной камере объёмом 1 мл. Наружные соединительнотканные оболочки ганглиев удаляли механическим путём, без применения ферментативной обработки, так как фермент может изменять нативное состояние исследуемых нервных клеток [6, с. 142–150]. Комплекс подглоточных ганглиев моллюска постоянно омывался протоком раствора Рингера для холоднокровных животных следующего состава (в миллимолях на 1 литр): NaCl — 100, KCl — 4, CaCl_2–10, MgCl_2–4, трис-HCl — 10 (pH 7,5) [4, с. 46–54].

Регистрацию электрических потенциалов нейронов и измерение их параметров проводили при температуре 18–21 ºС с помощью метода внутриклеточного отведения [4, с. 46–54]. Использовали заполненные 2.5 М раствором KCl стеклянные микроэлектроды с сопротивлением 10–30 МОм. Биопотенциалы усиливали с помощью УФУ-БКН (полоса пропускания 0–10 кГц) и через аналого-цифровой преобразователь передавали на компьютер IBM PC. Идентификацию нейронов осуществляли по электрофизиологическим и морфофизиологическим признакам под бинокулярным микроскопом МСПЭ-1 («Ломо») согласно карте А. Д. Сахарова [11, с. 21–139]. Запись потенциалов исследуемых нейронов и расчёт их характеристик выполняли с помощью компьютерной программы «Action Potential» [1] по схеме: фон (1 мин.), 5 мин. экспозиции раствора АСК в одной из концентраций (5∙10^–5, 5∙10^–4 и 5∙10^–3 М), отмывание раствором Рингера (20–30 мин.).

Перед аппликацией АСК перекрывали проток раствора Рингера для холоднокровных животных. Затем с помощью метода фиксации концентрации, который позволял за 20–50 мс сменить окружающий нейроны раствор на заданный экспериментатором, во внеклеточную среду однократно апплицировали АСК (химическая чистота по данным элементного анализа не менее 95 %), растворённый до необходимой концентрации раствором Рингера для холоднокровных животных (состав указан выше). Следует отметить, что АСК является весьма устойчивым комплексным соединением, константа диссоциации этой соли очень мала, и это позволяет исключить взаимодействие ионов Со²⁺ c мембранными каналами и компонентами растворов в условиях эксперимента [13, р. 1027–1043].

Анализировали следующие показатели электрических потенциалов нейронов: частота генерации импульсов (ЧГИ), длительность потенциала действия (ПД), суммарные входящие и выходящие трансмембранные ионные токи (их оценивали по кривым первых производных ПД), мембранный потенциал (МП). Для оценки достоверности результатов использовали непараметрический критерий Вилкоксона [8, с. 133–134]. Статистически значимыми считались различия значений показателей фона и эксперимента при p<0,05.

Результаты и их обсуждение. Внеклеточная аппликация 5∙10^–5, 5∙10^–4 и 5∙10^–3 М растворов АСК оказывала активирующее влияние на импульсную активность нейронов ППа1 и ППа2. В реакции нейронов ППа1 и ППа2 на приложение АСК в концентрациях 5∙10^–5 и 5∙10^–4 М можно выделить несколько фаз: 1) латентный период (ЛП) длительностью 40–60 с, в течение которого существенных изменений электрической активности нейронов не наблюдалось; 2) фаза возрастания ЧГИ в течение последующих 2–3 мин.; 3) фаза максимальной выраженности эффекта, которая проявлялась на 4–5 мин. экспозиции АСК. При отмывании нейронов от этой соли в тестируемых концентрациях параметры электрических потенциалов восстанавливалась в течение 7–15 мин.

С увеличением концентрации АСК до 5∙10^–3 М его эффекты на импульсную активность нейронов усиливались, что проявлялось в уменьшении амплитуды ПД и увеличении их длительности. Развитие реакции всех исследованных нейронов на экспозицию 5∙10^–3 М раствора АСК происходило в две фазы: 1) в течение 20–60 с после момента аппликации по сравнению с фоном увеличивалась ЧГИ, амплитуда ПД и уменьшалась продолжительность ПД, МП смещался в сторону деполяризации; 2) некоторое снижение ЧГИ по сравнению с фазой 1, уменьшение амплитуды ПД и увеличение его длительности по сравнению с фоном вплоть до начала отмывания. Данный эффект сохранялся на протяжении всего времени экспозиции вещества. В течение 30 мин. отмывания нейронов от АСК в этой концентрации параметры электрических потенциалов нейронов полностью не восстанавливались. Это, а также уменьшение данной концентрацией тестируемой соли амплитуды ПД и увеличение их длительности (табл. 1) является свидетельством некоторой токсичности АСК.

Выраженность эффектов 5∙10^–5, 5∙10^–4 и 5∙10^–3 М растворов АСК существенно варьировала у клеток ППа1 и ППа2 (табл. 1). У нейронов обеих групп при действии тестируемых концентраций АСК достоверно увеличивались ЧГИ (за исключением нейронов ППа2 при экспозиции АСК в концентрации 5∙10^–4, в этом случае происходило недостоверное повышение этого показателя). Также АСК в концентрации 5∙10^–4 М повышал (р≤0,01) амплитуду ПД, а в концентрации 5∙10^–4 М — наоборот снижал (р≤0,01) её. Во всех тестируемых концентрациях АСК уменьшал длительность ПД нейронов ППа1 и ППа2 (за исключением нейронов ППа2 при экспозиции 5∙10^–5 М раствора АСК, у которых изменения данного показателя носили противоположную направленность). Также наблюдались сдвиги МП в сторону деполяризации (достоверные или на уровне тенденции в зависимости от используемой концентрации АСК).

Таблица 1

Показатели электрических потенциалов нейронов ППа1 и ППа2 в фоне и на 5 минуте экспозиции ацетилсалицилата кобальта (АСК)

Примечание: ЧГИ — частота генерации импульсов, ПД — потенциалы действия, МП — мембранный потенциал.

Анализ первых производных ПД показал, что на 5 мин экспозиции АСК в концентрациях 5∙10^–5 и 5∙10^–4 М у нейронов ППа1 и ППа2 по сравнению с фоном достоверно увеличивал максимумы скорости нарастания суммарных входящих трансмембранных ионных токов (табл. 2), а в концентрации 5∙10^–3 М — вызывал достоверное снижение этого показателя. Скорости нарастания суммарных выходящих трансмембранных ионных токов, у нейронов ППа1 и ППа2 в зависимости от используемой концентрации АСК увеличивались либо уменьшались (достоверными изменения данного показателя были только у нейрона ППа1). При этом в концентрации 5∙10^–5 М АСК уменьшал (р≤0,05) изучаемый показатель, а в концентрациях 5∙10^–4 и 5∙10^–3 М — увеличивал (р≤0,05).

Таким образом, изменения скоростей нарастания входящих и выходящих трансмембранных ионных токов указывают на то, что АСК в концентрациях 5∙10^–5 и 5∙10^–4 М увеличивал проницаемость плазматических мембран нейронов ППа1 и ППа2 для Na⁺ (возрастание скорости входящих ионных токов) и снижал — в концентрации 5∙10^–5 М (уменьшение скорости входящих ионных токов); уменьшал в концентрации 5∙10^–5 М и увеличивал в концентрациях 5∙10^–4 и 5∙10^–3 М проницаемость плазматических мембран нейронов ППа1 для K⁺. Учитывая способность салицилатов повышать уровень циклических нуклеотидов — цАМФ и цГМФ [9, с. 4–8], которые способны модулировать функционирование Na⁺- и Cl^-- каналов [12, р. 488–520] и вносят вклад в активирующие нейротропные эффекты близких по структуре к АСК соединений — салицилатов кобальта и цинка [6, с. 142–150; 7, с. 11–18], мы предполагаем их участие и в эффектах АСК.

Таблица 2

Максимумы скоростей нарастания трансмембранных ионных токов нейронов ППа1 и ППа2 в фоне и на 5 минуте экспозиции ацетилсалицилата кобальта (АСК)

Примечание: ЧГИ — частота генерации импульсов, ПД — потенциалы действия, МП — мембранный потенциал.

АСК в концентрациях 5∙10^–5 и 5∙10^–4 М оказывал на электрическую активность исследуемых нейронов модулирующее влияние, поскольку наблюдалась дестабилизация МП, а мономодальный паттерн генерации ПД заменялся пачечным у 20 % нейронов ППа1 и ППа2. Экспозиция 5∙10^–3 М раствора АСК приводила к смене мономодального ритма пачечным у 30 % нейронов ППа1.

Особого внимания заслуживает тот факт (рис. 1), что АСК в концентрации 5∙10^–4 М инициировал у фоновонеактивных нейронов ППа1 и ППа2 (n=14) генерацию импульсной активности (результаты по этим нейронам не представлены в табл. 1 и 2). Это является ярким свидетельством активирующего нейротропного эффекта АСК.

Рис. 1. Активация фоновонеактивных нейронов (А-Б) 5∙10^–4 М раствором ацетилсалицилата кобальта (момент аппликации отмечен стрелкой).

В отношении механизма наблюдаемых изменений электрических потенциалов нейронов под влиянием АСК можно предположить, что он обусловлен не только воздействием на ионотропные рецепторы мембраны, но и возможным снижением уровня простагландинов вследствие ингибирования фермента циклооксигеназы [9, с. 4–8]. Так, известно, что снижение уровня простагландина F_2α, может стимулировать электрогенез нейронов [10, с. 580–588]. Однако эта гипотеза нуждается в экспериментальной проверке.

Выводы

1.         Ацетилсалицилат кобальта в концентрациях 5∙10^–5, 5∙10^–4 и 5∙10^–3 М оказывает активирующий эффект на электрические потенциалы нейронов ППа1 и ППа2, который связан с увеличением (5∙10^–5 и 5∙10^–4 М) или снижением (5∙10^–3 М) проницаемости плазматических мембран нейронов для Na⁺, а также снижением (5∙10^–5 М) или увеличением (5∙10^–4 и 5∙10^–3 М) проницаемости мембран для К⁺ у нейронов ППа1.

2.         Ацетилсалицилат кобальта можно рекомендовать к испытанию в качестве средства, обладающего стимулирующим эффектом на нервную систему.

Литература:

1.         А.с. № 1164229 Украина. Компьютерная программа для регистрации, обработки и автоматизированного анализа биоэлектрических сигналов / А. А. Замотайлов, И. И. Коренюк (Украина) № 1164229; опубл. 29.11.2004 г.

2.         Влияние ацетилсалициловой кислоты на электрическую активность нейронов улитки / И. В. Черетаев, Д. Р. Хусаинов, Т. В. Гамма и др. // Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье — 2012. — Т. 15. — С. 310.

3.         Влияние сверхмалых доз аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка на болевую чувствительность крыс / О. В. Катюшина, Т. В. Яковчук, И. И. Коренюк [и др.] // Успехи современного естествознания. — 2012. — № 9. — С. 28–31.

4.         Кононенко, Н. И. Механизмы генерации ритмоводящей активности в идентифицированных нейронах виноградной улитки / Н. И. Кононенко, О. В. Костюченко // Нейрофизиология / Neurophysiology — 2001. — Т. 33, № 1. — С. 46–54.

5.         Коваленко, В. Н. Компендиум — 2005 — лекарственные препараты / В. Н. Коваленко, А. П. Викторов. — К.: МОРИОН, 2005. — 1920 с.

6.         Коренюк, И. И. Влияние салициловой кислоты и её солей на электрическую активность нейронов виноградной улитки / И. И. Коренюк, Д. Р. Хусаинов, В. Ф. Шульгин // Нейрофизиология / Neurophysiology. — 2005. — Т. 37, № 2. — С. 142–150.

7.         Коренюк, И. И. Салицилаты кобальта и цинка как функциональные аналоги инициирующего фактора в нервной системе моллюска / И. И. Коренюк, Д. Р. Хусаинов, В. Ф. Шульгин // Нейрофизиология / Neurophysiology. — 2006. — Т. 38, № 1. — С. 11–18.

8.         Лакин, Г. Ф. Биометрия / Лакин Г. Ф. — М.: Высшая школа, 1990. — 352 с.

9.         Машковский, М. Д. Ацетилсалициловая кислота в ряду современных лекарственных средств / М. Д. Машковский // Хим.-фарм. журн. — 1994. — Т. 28, № 2. — С. 4–8.

10.     Никитин, В. П. Простагландины и функциональная специфичность нейронов виноградной улитки / В. П. Никитин, В. В. Шерстнёв // Нейрофизиология / Neurophysiology. — 1981. — Т. 13, № 6. — С. 580–588.

11.     Сахаров, Д. А. Генеалогия нейронов / Сахаров Д. А. — М.: Наука, 1974. — 184 с.

12.     Bender, A. T. Cyclic nucleotide phosphodiesterases: molecular regulation to clinical use / A. T. Bender, J. A. Beavo // Pharmacol. Rev. — 2006. — V. 58, № 3. — P. 488–520.

13.     Jabalpurwala, K. E. Metal ligand stability constants of some ortho-substituted phenols / K. E. Jabalpurwala, K. A. Venkatachalam, M. B. Kabadi // J. Inorg. Nucl. Chem. — 1964. — V. 26, № 6. — P. 1027–1043.

14.     Psychotropic effects of aspirin, acetylsalicylate cobalt and acetylsalicylate zinc at various doses / T. V. Yakovchyuk, O. V. Katiushyna, I. I. Koreniuk [et al.] // Health. — 2012. — V. 4, № 11. — Р. 1041–1045.