Ассоциация полиморфизма гена RYR1 с показателями продуктивных качеств свиней пород, разводимых в Беларуси

Резюме:Целью наших исследований является выявить ассоциацию гена RYR1 с воспроизводительной функцией, откормочной и мясной продуктивностью животных различных пород и породных сочетаний и возможность использования гена RYR1 в каче­стве маркера для селекции свиней на устойчивость к стрессу.

Ключевые слова: свиньи, ген рианодинового рецептора, полиморфизм, аллель, генотип, ПЦР-ПДРФ, ДНК, продуктивные признаки.

Summary:Aim of the research is to reveal association of a gene of RYR1 with reproductive function, feeding and meat efficiency of animal various breeds and pedigree combinations and possibility of use of a gene of RYR1 in quality of a marker for selection of pigs on resistance to a stress.

Keywords:pigs, RYR1 gene, polymorphism, allele, genotype, PCR-RFLP, DNA, productive traits.

Введение. При интенсивной селекции на мясность и растущей популярности по­род, применяемых для улучшения мясных качеств отечественных пород и полу­чения товарных гибридов, отмечается значительное увели­чение частоты встречаемости предрасположенных и чувст­вительных к стрессу животных среди племенных и помес­ных свиней, разводимых в Республике Беларусь (от 7 до 100%), вследствие чего наблюдается по­вышенный отход поросят, снижение откормочной и мясной продуктивности, а также каче­ства свинины.

Синдром стресса свиней PSS (Porsine Stress Syndrome), проявляющийся в смертности стрессируемых животных, биохимических изменениях в скелетной муску­латуре свиней по­сле убоя (в виде патологически бледной, водянистой, мягкой свинины – PSE или, наоборот, темной, сухой, жесткой свинины – DFD) и чувствительности к ин­дуцируемой стрессом зло­качественной гипертермии MHS (Malignant Hypertermia Syndrome) является одной из важ­нейших проблем современного мясного свиноводства [1, 2].

Чувствительные к стрессу свиньи характеризуются более низким уровнем репродук­тивных и от­кормочных качеств. В то же время, известно, что стрессчувствительные свиньи – носители злокачественной гипертермии – отличаются более высокой мясностью туш. В связи с чем, задачей наших исследований является изучение ассоциации полиморфизма гена RYR1 с показателями продук­тивных качеств свиней пород, разводимых в Беларуси.

Материалы и методы.

Исследования проводились в научно-исследовательской лаборатории ДНК-техно­логий УО «ГГАУ» и РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству». Объектом исследований являлись свиноматки белорусской крупной белой, белорусской мясной пород, чистопородный и помесный молодняк, ремонтные хряки белорусской крупной белой и белорусской мясной пород. В исследуемой группе свиноматок с различными генотипами по гену RYR1 изучали следующие репродуктивные качества: многоплодие (гол), масса гнезда при рождении (кг), молочность (кг), масса гнезда при отъеме (кг), и др. В группе откормочного молодняка определяли возраст достижения живой массы 100 кг (дней), среднесуточный прирост (г) и затраты корма на 1 кг прироста живой массы (к.ед). У ремонтных хряков белорусской крупной белой и белорусской мясной пород изучали показатели собственной продуктивности: скорость роста (дней), толщина шпика (мм). Условия содержания и кормления подопытных животных были одинаковыми. В процессе работы методом ПЦР-ПДРФ анализа исследован полиморфизм гена RYR1. ДНК экстрагировали из проб ткани уха животного перхлоратным методом. Для ам­плификации участка генов RYR1 использовали праймеры: RYR1: - GTG CTG GAT GTC CTG TGT TCC CT - 3′, RYR2: - CTG GTG ACA TAG TTG ATG AGG TTT G - 3′.

ПЦР программа: «горячий старт» - 4 мин при 94ºС; 30 циклов: денатурация – 30 сек при 94ºС, отжиг – 30 сек при 60ºС, синтез – 30 сек при 72ºС; достройка – 5 мнут при 72 ºС.

Амплификацию гена RYR1 проводили с использованием реак­ционной смеси объемом 25 мкл, содержащая 1xTaq-буфер, 2 мМ дНТФ (4 x 0,5 мМ каждого), 10 пМ каждого праймера, 1,5 ед. акт. Taq-полимеразы, 100-200 нг геномной ДНК.

Концентрацию и специфичность амплификата оценивали электрофоретическим мето­дом в 2% агарозном геле. В качестве маркера молекулярного веса использовали 50 bp DNA Ladder, рас­щепленную рестриктазами. Длина фрагмента гена RYR1 – 134 п.о.

Оптимизированы параметры проведения рестрикции. Для рестрикции амплифициро­ванного участка гена RYR1 использовали эндонуклеазу HhaΙ. Продукты рестрикции гена RYR1 разделяли электрофоретически в 4% агарозном геле.

Результаты и их обсуждение. Поскольку стрессустойчивые животные ха­рактеризуются более высокими репродук­тивными качествами в сравнении с чувствитель­ными и предрасположенными к стрессу, даже невысокая частота встречаемости рецессив­ного аллеля RYR1ⁿ в масштабах промышленного произ­водства приводит к значительному экономическому ущербу отрасли свиновод­ства, так как является существенной причиной более низкой сохранности молодняка (Таблица 1).

Таблица 1

Показатели репродуктивных качеств свиноматок белорусской крупной белой породы с различными гено­типами по гену RYR1

Примечание: здесь и далее – уровень достоверности при * – Р<0,05, ** – Р<0,01, *** – Р<0,001

У свиноматок крупной белой породы с генотипом RYR1^Nn на 1,11 голов (Р<0,05) рождалось больше живых поросят при более высокой массе гнезда при рожде­нии (на 2,51кг (Р<0,001). В то же время, сохранность поро­сят была ниже, чем у маток с генотипом RYR1^NN (на 25,8%), кроме того, у них был увеличен удельный вес мертворожденных поросят (на 3,2%) и количество аварийных опоросов (на 5,4%). Энергия роста молодняка и сохран­ность к 21 дню были выше у устойчивых к стрессу животных с достоверным преимуществом (Р<0,001).

Более высокое многоплодие наблюдалось у маток белорусской крупной белой породы с генотипом RYR1^Nn в сравнении с доминантными гомозиготами RYR1^NN что,по-видимому, связано с большей жизне­способностью гетерозигот, которая проявляется при благоприятном действии модификационных факторов и является характерной особенностью материнских пород. Однако, не­смотря на полученные нами достоверные различия между генотипами, выявленная за­коно­мерность требует дальнейшего изучения не только у маток белорусской крупной по­роды.

У белорусской мясной породы устойчивые к стрессу матки имели пре­имущество по многоплодию на 8,8% (Р<0,05), в том числе по количеству жи­вых поросят – на 11,1% (Р<0,01) и массе гнезда при рождении – на 11% (Р<0,01) (Таблица 2).

Таблица 2

Показатели репродуктивных качеств свиноматок белорусской мясной

породы с различными генотипами по гену RYR1

У маток с гетерозиготным генотипом RYR1^Nn на 2,5 п.п. больше рождалось мертворож­денных поросят, и на 3,4 п.п. выше был процент аварийных опоросов. Очевидно более высокая сохранность поросят и незначительное (p>0,05) превышение показателей развития поросят (массы гнезда в 21 день и при отъеме) у маток с генотипом RYR1^Nn наблюдается за счет технологической подсадки.

Полученные нами данные показали, что устойчивые к стрессам матки имели выше (на 15 п.п.) оплодотворяемость, многоплодие (на 0,6 поросенка), живую массу поросенка при отъ­еме (на 1,1 кг), и сохранность поросят (на 10,2 п.п.).

Результаты наших исследований свидетельствуют о неблагоприятном влиянии RYR1-гена на репродуктивные качества свиноматок, жизнеспособ­ность и сохранность поросят.

В проведенных ранее исследованиях, молодняк с гомозиготным генотипом RYR1^NN характеризо­вался более высокой скоростью (179,1 дня) и энергией роста (732,4 г; Р<0,01), низкими за­тратами корма на 1 кг прироста (3,64 к. ед.; Р<0,05), а также более длинной тушей (98,9 см; Р<0,01) и тонким шпиком (25,2 мм), что значительно превышало аналогичные показатели живот­ных с генотипом RYR1^Nn (соответственно на 3,5 дней, или 1,9%; 33,1 г – 4,7%; 0,14 к. ед. – 3,7%; 1,3 см – 1,3%; 2,4 мм – 8,7%).

Достоверных различий между генотипами RYR1^NN и RYR1^Nn по величине показате­лей площадь «мышечного глазка» и масса окорока не установлено. Выявлено также, что животные, характеризу­ющиеся предрасположенностью к стрес­сам, имели более высокое содержание мяса в тушах. Результаты обвалки полутуш показали, что у гетерозиготных животных RYR1^Nn количество мяса на 9,1% было выше, чем у гомози­готных RYR1^NN, с одновременно более высо­ким содержанием сала (на 10%) [3, 4, 5, 6, 7, 8].

Полученные нами данные согласуются с результатами исследований E. Krzęcio,F. Zhang et al., которые рекомендует получать гетерозигот­ные RYR1^Nn генотипы, что ведет к повышению мясности туш в срав­нении с тушами животных, устойчивых к стрессу RYR1^NN, но у них реже, чем у гомозигот RYRⁿⁿ, встречается мясо с пороком PSE. По данным T. Hardge et al. [9], влияние RYR1-генотипа на признаки туши составляет от 3,5 до 27%, на критерии качества мяса – до 60%, на прирост живой массы – до 10%.

Широкое использование в селекционном процессе животных мясных пород ландрас и пьетрен зарубежной селекции привело к увеличению концентрации аллеля RYR1ⁿ у гибрид­ного молодняка, полученного при сочетании свиней белорусских пород с вышеназванными зарубежными, что может оказать негативное влияние на про­явление откормочной и мясной продуктивности (Таблица 3).

Таблица 3

Влияние полиморфизма гена RYR1 на показатели откормочной продуктивности чистопородного и помесного молодняка

В результате проведенных исследований выявлено положительное влияние генотипа NN по RYR1 на проявление откормочной про­дуктивности, как помесного, так и чистопородного молодняка белорусской черно-пестрой и крупной белой пород [10]. Так, у гетерозиготного молодняка наблюдается снижение скоро­сти роста на 0,8–2,9 дня, энергии роста – на 51г (Р<0,05) – 59 (Р<0,001) г и увеличение за­трат корма на 0,19–0,21 (Р<0,01) к. ед.

Помесный молодняк белорусской черно-пестрой породы с кровностью 25% породы ландрас, свободный от точковой мутации злокачественной гипертермии, превосходил жи­вотных генотипа RYR1^Nn по откормочной продуктивности на 8,4–5,1% (Р<0,01). У гибридного молодняка с кровностью 25% породы пьетрен превосходство по энергии роста и расходу корма на единицу прироста со­ставило 7% (Р<0,05) и 5,9% (Р<0,01) соответственно, а по мясным показателям – 0,3–7,1%.

Изучая показатели мясной продуктивности свиноматок, в том числе и двухпородный молодняк, полученный от скрещивания гибридных хряков генотипа 1/2БКБ1/2Л и свиноматок крупной белой породы, свободной от мута­ции в гене RYR1, харак­теризовался высокими откормочными качествами, но уступал в мясности помесям с RYR1^Nn генотипом по толщине шпика над 6–7 грудными позвонками на 5% и площади «мышечного глазка» – на 0,9%, однако эти различия находятся в пределах статистической ошибки.

Таким образом, в наших исследованиях выявлено достоверное снижение показателей откормочной продуктивности животных-носителей рецессивного аллеля RYR1ⁿ, что свиде­тельствует о необходимости проведения обязательного генетического контроля его наличия и распространения у отечественного и импортируемого поголовья животных.

Необходимо отметить, что при соблюдении оптимальных норм технологии кормления и содержания животных можно снизить воздействие стресса и избежать негативного воздей­ствия злокачественной гипертермии.

Также нами изучено влияние полиморфизма гена RYR1 на показатели собственной продук­тивности ремонтных хрячков белорусской крупной белой и белорусской мясной пород, в результате чего установлена тенденция к снижению показателей скорости роста (на 3 дня) и толщины шпика (на 1,3 мм) у животных крупной белой породы с гетерозиготным генотипом RYR1^Nn по сравнению с гомозиготными сверстниками, однако ввиду наличия оптимальных норм кормления и содержания, снижающих стрессовую нагрузку, достоверных различий не обна­ружено.

Анализ полученных нами данных позволяет сделать вывод, что наличие мутации в гене RYR1 является признаком физиологической нестабильности животного. Именно к та­кой нестабильности приводит односторонняя селекция животных на повышение мясности без учета других хозяйственно полезных признаков (конституциональная крепость, высокая жизнеспособность и т. д.). В результате такой селекции созданы супермясные породы и типы свиней (пьетрен, бельгийский и немецкий ландрас и другие), использование которых способ­ствует снижению резистентности животных к стрессу и ухудшению качества мяса, появле­нию пороков мяса PSE и DFD, что снижает его технологические свойства. Свинина от жи­вотных с такими пороками имеет непривлекательный вид, непригодна для употребления в свежем виде, для технологи­ческой переработки и производства копченых продуктов. Только в Швеции [11] от PSE-синдрома ежегодный экономический ущерб составляет более 50 млн. шведских крон, в Англии – 800 тыс. ф. ст., в США – 250 млн. долларов.

Выводы. Выявленные ассоциации гена RYR1 воспроизводительной функцией, откормочной и мясной продуктивностью животных различных пород и породных сочетаний свидетельствуют о возможности использования гена RYR1 в каче­стве маркера для селекции свиней на устойчивость к стрессу.

Литература:

1.                  Князев, С.П. Проблемы дискордантности и косегрегации экспрессии гало­тан-чувствительности свиней с мутацией 1843 С-Т в локусе RYR1 рецептора рианодина / С.П. Князев, К.Е. Жучаев, В.В. Гарт // Генетика. – 1998. – Т. 34, № 12. – С. 1648–1654.

2.                  Марзанов, Н.С. RYR1-ген у свиней отечественных и зарубежных пород / Н.С. Марзанов, Д.А. Фролкин, Н.А. Зиновьева // Доклады Российской Академии сельскохозяй­ственных наук. – 2001. – № 1. – С. 34–36.

3.                  Детерминация продуктивности свиней белорусской мясной породы, обусловлен­ная геном RYR1 / И.П. Шейко [и др.] // Молекулярная генетика, геномика и био­технология: материалы конф., г. Минск, 24–26 нояб. 2004 г. – Мн., 2004. – С. 277–278.

4.                  Епишко, Т.И. Влияние полиморфизма гена RYR1 на механизмы физиологиче­ской реактивности организма свиней / Т.И. Епишко // Эпизоотология, иммунобиология, фармакология, санитария. – 2005. – № 1. – С. 49–54.

5.                  Епишко, Т.И. Генетические основы породообразования / Т.И. Епишко // Зоотех­ническая наука Беларуси: сб. науч. тр. Т. 42. – Жодино, 2007. – С. 57–66.

6.                  Полиморфизм гена RYR1 в популяции белорусской мясной породы свиней и его ассоциация с процессами метаболизма и продуктивными качествами / И.П. Шейко [и др.] // Доклады РАСХН. – 2004. – № 5. – С. 30–32.

7.                  Шейко, И.П. Генетические методы интенсификации селекционного процесса в свиноводстве: моногр. / И.П. Шейко, Т.И. Епишко; Ин-т животноводства НАН Беларуси. – Жодино, 2006. – 197 с.

8.                  Polymorphism of gene RYR1 in a Belarus meat-type pig and its association with meta­bolic processes and productive qualities // Russian Agricultural Sciences. – 2005. – N 9. – Р. 21–24.

9.                  Hardge, T. / T. Hardge, A. Scholz // Faculty of Agriculture and Hortculture, Institute of Basic Animal Science. – Berlin, 2001. – P. 320–325.

10.              Использование ДНК-технологий при определении стрессовой чувствительно­сти и продуктивности свиней / И.П. Шейко [и др.] // Вести НАН Беларуси. Сер. аграрных наук. – 2005. – № 3. – С. 76–78.

11.              Сердюк, Г.Н. Иммуногенетические маркеры и их использование для повыше­ния эффективности селекции свиней: автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.15 / Сердюк Г.Н. – СПб-Пушкин, 2000. – 58 с.