В данной статье приводятся применения фосфора и некоторых микроорганизмов, в частности почвенных фосфатрастворяющих штаммов грибов в сельском хозяйстве.
Известно, что в настоящее время интенсивно разрабатываются принципы и методы биологизации земледелия. Они должны быть научно обоснованы с точки зрения экологической безопасности. Этот подход основывается на широком внедрении биотехнологий с минимальным использованием средств химизации.
Известно, что широкое применение химизации привело к росту нагрузки на полей и на агроландшафты. Использование азотных и фосфорных удобрений привело к ухудшению естественного потенциала и плодородия почв. В почве накопилось много нерастворимые соединения, так называемые балласты. В первую очередь это относится к фосфорсодержащим соединениям.
Фосфор играет важную роль в общем метаболизме растительной и животной клетки, входя в состав различных соединений, выполняющих не только роль структурных элементов, но и определенные функции. Важное значение соединений типа НАД (никотинамидадениндинуклеотид), НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), АТФ (аденозинтрифосфорная кислота), ДНК, РНК и других, содержащих фосфор, подчеркивает необходимость обеспечения растений этим элементом [1]. Фосфор кроме этого оказывает основное определяющее влияние на многие биохимические процессы в растениях и фотосинтез... При его недостатке в растениях тормозится синтез белков и углеводов, происходит задержка роста и созревания, урожай резко снижается. Улучшение фосфатного режима почв и фосфорного питания растений крайне необходимо еще в связи с тем, что при фосфорном голодании заметно снижается эффективность всех других питательных элементов — тормозится поглощение азота, калия, вносимого с удобрениями, а также макро- и микроэлементов корнями растений и передвижение их в надземные органы. Растения используют фосфорные соединения главным образом в виде анионов H2PO4- и HPO42- из солей ортофосфорной кислоты (Н3РО4), а также из солей полифосфорных кислот (после их гидролиза). Отсюда вытекает важное обстоятельство: для того чтобы обеспечить успешный рост и развитие культурных растений, необходима, довести фосфор до вышеперечисленных ионов в почвенном растворе. Однако свыше 80 % вносимого фосфора, в результате химических реакций в почве, закрепляется в составе нерастворимых соединений. Этот процесс, так называемый «ретроградация» фосфора приводит к снижению коэффициента использования вносимых минеральных удобрений. Ситуация усугубляется обширным применением комплексных удобрений, до 15–20 %, содержащих помимо фосфора азот и калий, что влечет накопление и избыток одних при недостатке других элементов [2]. Такой дисбаланс отражается как на качестве производимой сельскохозяйственной продукции, так и на урожае в целом.
Таким образом, с удобрением фосфор вносится значительно больше, чем выносится растениями с урожаем, что приводит к «зафосфачиванию» почвы при фосфорном голодании выращиваемых сельскохозяйственных культур. В частности, на карбонатных сероземах Узбекистана часто именно недостаток усвояемого фосфора является главным лимитирующим фактором для устойчивого развития и повышения урожайности культурных растений. Поэтому в настоящее время всевозрастающий дефицит фосфора становится проблемой государственного масштаба, на решение которой должны быть направлены усилия специалистов.
Одним из путей решения этой проблемы может стать применение почвенных микроорганизмов, в частности грибов, способных к растворению труднодоступных почвенных фосфатов.
Микроорганизмы, мобилизующие минеральные и органофосфаты, выделяются из разных природных объектов: почвы, поверхности корней растений, фосфоритной руды и др. В общем составе почвенной микрофлоры количество микроорганизмов, способных растворять природные фосфаты, составляет от 1 до 35 % [3]. К фосфатрастворяющим микроорганизмам можно отнести азотобактерии, алюмосиликатные и тионовые бактерии, бациллы (Bac. cereus, Bac. polymyxa, Bac. megaterium, Bac. Subtilis), неспоровые бактерии (Pseudomonas fluorescens, Ps. striata) и др. Особую роль в растворении фосфатов играют почвенные грибы, относящиеся к таким родам как Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma и другие. Они относятся к различным таксономическим группам и во многих почвах благодаря своей многочисленности могут существенно влиять на процесс мобилизации фосфатов.
При поиске эффективных культур грибов необходимо использовать и отбирать местные (эндемичные) штаммы из ризосферы растений, под которые планируется интродукция, учитывая технологию выращивания сельскохозяйственной продукции, а также почвенные и климатические условия Узбекистана. Почвенными можно считать грибы, которые постоянно и закономерно выделяются как из почвы, так и из различных субстратов, находящихся в ней (опавших листьев, подстилки, корней и семян растений, других растительных остатков и животных субстратов).
Почвенные грибы не являются единой таксономической группой и представлены самыми разнообразными в систематическом отношении формами. Они не представляют собой также единой экологической группы, так как включают разные эколого-трофические формы: сапротрофы, патогены растений, микоризообразователи, грибы — хищники. Их объединяет только общее местообитание в широком смысле — почва. Однако основную массу почвенных грибов все же составляет группа сапрофитов, т. е. организмов, осуществляющих разложение отмерших органических субстратов, которые могут быть выделены как непосредственно из почвы, так и из различных животных и растительных остатков.
Несмотря на большое таксономическое разнообразие почвообитающих сапрофитных грибов и их функций (в настоящее время к почвенным грибам можно отнести до 3000 видов), они представляют собой единое звено в трофической цепи любой экосистемы, в состав которой входит почва, осуществляя в ней функцию организмов — редуцентов. Их основная роль проявляется в разложении органического вещества в разных его формах, в результате чего происходит новообразование различных соединений, поступающих в почву и вовлекаемых непосредственно в дальнейший обмен, таких как разнообразные органические кислоты, физиологически активные вещества, высокомолекулярные полимерные соединения, часть из которых свойственна метаболизму только грибов. Основными факторами, определяющими состав комплекса грибов в почве, является характер субстрата (органическое вещество почвы, растительные и животные остатки) и конкурентоспособность популяции каждого вида за захват этого субстрата. Наличие сходного субстрата и его составляющих (сахаров, гемицеллюлоз, пектина, целлюлозы и т. д.) в растительных остатках, а, следовательно, и в почвах любого биогеоценоза определяет весь набор трофических групп грибов в каждой почве.
В целях изучения эффективности фосфатрастворяющих штаммов грибов из ризосферы хлопчатника, необходимо решать задачи, как выделение чистых культур грибов, определение их систематической принадлежности, получение на их основе препаратов, способствующих мобилизации почвенных фосфатов и повышению коэффициента полезного действия вносимых фосфорных удобрений и т. д.
Нами были изучены эффективности грибов методами меченых соединений фосфором — 32, для чего предлагается следующие методы исследований.
1. Получение меченого радиоактивным ФОСФОРОМ — 32 трикальцийфосфата Са3(РО4)2
Для того чтобы исследовать поведение фосфора в почве необходимо получить те нерастворимые соединения (содержащие радиоактивную метку — фосфор-32), в которые он превращается при внесении в виде удобрений, то есть как бы создать модель протекающих на практике процессов. Поэтому перед нами стояла задача смоделировать эти процессы, происходящие в природных условиях и исследовать их. Не имеет существенной разницы, в каких именно формах закрепляется фосфор в виде нерастворимых соединений при внесении в почву, главное нужно было получить их для исследований, пометив радиоактивной меткой и чтобы они не вымывались водой из почвы, с тем чтобы в последующем отыскать способы высвобождения этого фосфора с помощью микроорганизмов [4]. Учитывая относительно короткий период полураспада радиоактивного фосфора Р-32 (14,5 дней) и с целью согласования по времени начало и конец очередного эксперимента требуется каждый раз готовить новую порцию радиоактивного трикальцийфосфата Са3(РО4)2, содержащего фосфор-32. В экспериментах использовали меченую изотопом Р-32 ортофосфорную кислоту (H3P32O4), производимую в ИЯФ АН РУ в объединении «Радиопрепарат». Для получения радиоактивного трикальцийфосфата Са3(Р32О4)2 к ортофосфорной кислоте в количестве 10 мл добавили 100 мКи меченной Р-32 Н3Р32О4 и тщательно размешали. Таким образом, получали изотопное разбавление исходной ортофосфорной кислоты. В эту смесь, после нагревания на водяной бане до 700С, осторожно добавляли по 1 мл известкового молока (насыщенный водный раствор гидроокиси кальция Ca(OH)2 (гашёной извести). 1 л известковой воды при 20°С содержит около 1,2 г CaO) до нейтральной реакции рН раствора. Выпавший осадок тщательно промывали бидистиллированной водой, чтобы освободиться от не связавшейся метки и полученный осадок сушили (Рис.1.). Полученный таким образом радиоактивный трикальцийфосфат Са3(РО4)2 затем использовался в экспериментах по сравнительному анализу выделенных из ризосферы новых штаммов грибов на способность разлагать данное нерастворимое в воде соединение фосфора.
2. Исследование влияния рН среды на растворимость трикальцийфосфата Са3(РО4)2 в воде
Концентрация ионов водорода (рН) оказывает очень сильное влияние на жизнедеятельность микроорганизмов. Иногда микроорганизмы не развиваются только из-за того, что в среде создается неблагоприятное для их развития рН. Для каждого микроорганизма существуют оптимальные, минимальные и максимальные значения рН окружающей среды. Однако считают, что все микроорганизмы, даже растущие при экстремальных значениях рН, располагают определенными механизмами для поддержания внутриклеточного рН на уровне, близком к нормальным физиологическим величинам. В почве есть микроорганизмы, имеющие либо узкий, либо широкий диапазон рН, в котором возможно их развитие: одним нужна нейтральная, другим — кислая, а третьим — щелочная среда. Хотя это может показаться на первый взгляд странным, но из каждого типа почвы вне зависимости от ее рН выделяются все группы микроорганизмов, резко отличающиеся по их отношению к кислотности [3]. Это связано с существованием в каждой почве различных микро- и мезозон, резко отличающихся по кислотности. Следует отметить, что рН водной или солевой вытяжки из почвы дает возможность судить только об усредненном значении рН. Эта величина, естественно, не может характеризовать условия существования в отдельных микрозонах. В зонах с повышенным выделением СО2, например, на поверхности корней, будут создаваться зоны с более низкими значениями рН. При внесении в кислые почвы вокруг гранул удобрения будут создаваться особые микрозоны с нейтральной реакцией. В кислой почве вблизи разлагающегося белка может создаваться щелочная среда. В щелочных почвах в результате локального развития процессов нитрификации могут возникать микрозоны с кислой реакцией среды. Особое значение рН создается на поверхности почвенных частиц. Здесь создается большая концентрация ионов водорода из-за его адсорбции на отрицательно заряженных поверхностях.
Полученный нами для экспериментальных целей трикальцийфосфат обладает, как любое другое соединение, рядом свойств. Одним из важных для нас параметров является его растворимость в воде в зависимости от рН среды. Известно, что многие растения и микроорганизмы, обитающие в почве, добывают фосфор из нерастворимых в воде фосфатов путем выделения в среду различных органических кислот. Подкисляя среду, они, тем самым, вызывают растворение фосфатов, которые трансформируются в более доступные для усвоения формы в виде растворимых в воде фосфат — ионов. Для того чтобы смоделировать этот процесс был использован синтезированный трикальцийфосфат, содержащий в своем составе радиоактивную метку Р-32. Навески этого вещества (по 0,3 грамма) поместили на дно химических стаканов емкостью по 50 мл, затем осторожно заливали 10 мл раствора 0,2М триацетатного буфера с разными значениями рН и оставили при комнатной температуре на одни сутки. После этого из каждого стакана отбирали пробу в количестве 1 мл для измерения радиоактивности на счетчике ГСУ-1. Анализ результатов измерений (таблица 3) показывает, что растворение трикальцийфосфата в водной среде начинается при рН=6.5, возрастая дальше по нелинейной пропорции.
Таблица 1
Растворимость Са3(РО4)2 в воде при изменении рН среды
|
РН |
7.5 |
7.0 |
6.5 |
6.0 |
5.5 |
5.0 |
4.5 |
4.0 |
3.5 |
3.0 |
|
Cpm |
54 |
57 |
168 |
291 |
513 |
1132 |
2859 |
5945 |
8917 |
11452 |
Эти данные показывают также, что для того, чтобы получать фосфор из фосфатов микроорганизмы должны существенно подкислять окружающую среду, поскольку почва обладает большой буферной емкостью и если в ней имеется какой-то пул фосфатов, требуется сделать почвенный раствор вокруг этих микрочастичек почвы кислой до значения рН=6.5 и ниже.
ВЫВОДЫ
1. Получен меченный радиоактивным фосфором-32 трикальцийфосфат Са3(РО4)2 для исследовательских целей. Это послужило основой для разработки модельной системы с целью изучения поведения фосфора и метода для количественной оценки способности выделенных штаммов почвенных грибов разлагать труднодоступные соединения фосфора.
2. Проведены исследования влияния рН среды на растворимость трикальцийфосфата Са3(РО4)2 в воде. На модельной системе показано, что для того, чтобы извлекать фосфор из нерастворимых соединений в почве грибы должны окислять среду до рН=6,5.
Литература:
1. Газиходжаева М. А. Главнейшие виды почвенных грибов в ризосфере хлопчатника, люцерны и кукурузы. ДАН УзССР, № 4. Ташкент, 1970.
2. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы., Москва.,1990., Изд-во МГУ
3. Мухамеджанов М. В., Теслинова Н. А. Микроорганизмы и повышение плодородия орошаемых сероземов. Ташкент.,1990г. Изд-во «Фан».
4. Джуманиязова Г. И., Таджиев А. Ю., Тахтобин К. С., Тиллаев Т. С. Растворение трикальцийфосфата фосформобилизующими ризобактериями. Узбекский биологический журнал, 2006; 1, 2. стр.18–22.
