Методом направленной селекции с использованием химического и физического мутагенеза получен новый штамм-продуцент гидролитических ферментов. На основе штамма получен ферментный препарат и исследована его биохимическая характеристика. Подтверждена эффективность действия ФП для деструкции растительного и микробного сырья.
Ключевые слова:мутагенез, ферментный препарат, деструкция, штамм-продуцент, гидролазы.
The newproducing strain of hydrolytic enzymeswas obtained bydirected selection using chemical and physical mutagenesis. Based on the strain enzyme preparation was obtained and its biochemical characteristics was investigated. The effectiveness of the enzyme preparation for the degradation of plant and microbial material was confirmed.
Keywords: mutagenesis, enzyme preparation, destruction, producing strain, hydrolases.
Мировое производство ферментных препаратов (ФП) ежегодно растет и обеспечивает данной продукцией агропромышленные комплексы (АПК) ведущих развитых стран. Такая тенденция обусловлена более широким использованием современных биотехнологических процессов во многих отраслях АПК. При этом растет спрос не только на ФП для производства спирта, пива, безалкогольных напитков и кормов, составляющих основу биотехнологических производств нашей страны, но и для хлебопекарной, кондитерской, масложировой, мясной и молочной промышленности [1–3]. Кроме того, возрос интерес к созданию «чистых» продуктов (не содержащих химических добавок), продуктов функционального назначения и БАД, для производства которых используются сырьевые источники растительного и микробного происхождения. Ферментативная деструкция в этом случае позволяет повысить пищевую и биологическую ценность получаемой продукции, в результате максимального извлечения БАВ из нативного сырья [4–6].
Поэтому, разработка и совершенствование технологий производства комплексных ферментных препаратов, обеспечивающих эффективную биокаталитическую деструкцию высокомолекулярных полимеров растительного, животного и микробного сырья в перерабатывающих отраслях АПК является актуальным направлением научных исследований.
Одним из перспективных продуцентов пектиназ является штамм Aspergillus foetidus 379-K, полученный ранее с использованием генетических и селекционных методов [7]. Исследования состава ферментативного комплекса, синтезируемого этим микромицетом, показали его многокомпонентность, что позволит использовать его в дальнейших селекционных работах направленных на увеличение биосинтетической способности в отношении полимеров не только растительного, но и микробного сырья.
Объектами исследования служили микромицеты рода Aspergillus, которые являются продуцентами богатого комплекса гидролитических ферментов, обеспечивающих эффективную деструкцию полимеров растительного и микробного сырья.
В связи с вышеизложенным, цель данной работы состояла в получении штамма — продуцента комплекса гидролитических ферментов, эффективного в отношении деструкции основных полимеров растительного и микробного сырья для увеличения выхода ценных биологически активных веществ.
Работы по получению нового продуцента с повышенной экспрессией ферментов на основе штамма A. foetidus 379К проводили с использованием ступенчатого воздействия мутагенов химической и физической природы. В качестве химического мутагена в работе использовали N–метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин (нитрозогуанидин). Данный препарат относится к группе алкилирующих агентов и обладает высоким мутагенным эффектом.
Для проведения второй ступени мутагенеза, целью которого являлось дальнейшее повышение биосинтетической способности штамма и получение стабильного мутанта был выбран физический мутаген широкого спектра действия — УФ-облучение.
Рис. 1 Повышение биосинтетической способности штамма после химического и физического воздействия
Таким образом, в результате многоступенчатой селекции был получен штамм Aspergillusfoetidus379К-5–1, по уровню активностей который превышает родительский штамм: по β-глюканазе на 65,5 %, ксиланазе на 38,1 %, целлюлазе на 34,7 %, хитиназе на 88,3 %, маннаназе на 97,0 %, протеазе на 38,5 %, и полигалактуроназе на 85,2 % (рис.1).
На основе полученного нового мутантного штамма на подобранной ферментационной питательной среде был наработан ферментный препарат степени очистки Г20Х (табл.1).
Таблица 1
Биохимическая характеристика ФП Глюканофоетидин Г20Х
|
Фермент |
Значение активности, ед/г |
Фермент |
Значение активности, ед/г |
|
β-глюканаза |
1125 |
Глюкоамилаза |
135 |
|
Полигалактуроназа |
611 |
Протеаза |
85 |
|
Целлюлаза |
328 |
Маннаназа |
71 |
|
Ксиланаза |
264 |
Хитиназа |
30 |
|
Липаза |
137 |
|
|
Подтверждена мультикомпонентность ферментативного комплекса с преимущественным содержанием b-глюканазы и полигалактуроназы, с разнообразным составом гемицеллюлаз, а также наличием глюкоамилазы, протеазы и липазы.
Проведение ряда экспериментов по исследованию биодеградации сырья растительного и микробного происхождения подтвердило эффективность использования нового ферментного препарата Глюканофоетидин, полученного на основе штамма Aspergillusfoetidus379K-5–1.
Использование полученного ферментного препарата Глюканофоетидин позволило:
— в процессе деструкции ягодного сырья увеличить выход сока в 3 раза, содержание редуцирующих и общих фенольных веществ на 13,0 и 4,7 % соответственно;
— в процессе биоконверсии зернового сырья повысить выход экстракта на 40 %, редуцирующих веществ — в 4 раза и белковых веществ в 5 раз;
— в процессе деструкции клеточных стенок дрожжей повысить выход экстракта на 20 %, в 8 раз увеличить содержание редуцирующих сахаров за счет гидролиза полисахаридов клеточной стенки дрожжей, и на 36,5 % содержание белковых веществ.
Исследования выполнены по гранту Президента РФ для поддержки молодых российских ученых-кандидатов наук МК-575.2014.4
Литература:
1. Грачева, И. М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева, А. Ю. Кривова. — М.: Изд-во «Элевар», 2000. — 512 с.
2. Бирюков, В. В. Основы промышленной биотехнологии / В. В. Бирюков. — М.: Изд-во «Колос», «Химия», 2004. — 295 с.
3. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов / О. В. Кислухина. — М.: Изд-во «Дели принт», 2002.- 336 с.
4. Бушина, Е. В. Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium: дисс. канд. хим. наук / Е. В. Бушина, МГУ им. М. В. Ломоносова. М., 2012.- 132 с.
5. Поверин, А. Д. Биологически активная пищевая добавка на основе ферментативного гидролизата пивных дрожжей /А. Д. Поверин // Пиво и напитки, 2008. — № 3. — С. 21–26
6. Поляков, В. А. Биологически активные добавки микробного происхождения как фактор, формирующий функциональные свойства пищевых продуктов / В. А. Поляков [и др.] // Хранение и переработка сельхозсырья. 2013. — № 12. — с. 43–47
7. Соколова, Е. Н. Изучение физиолого-морфологических и биохимических свойств Aspergiluus foetidus МБ-4 — продуцента пектолитических ферментов / Е. Н. Соколова [и др.] // Сб. научных трудов «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК». — М., 2006. — с. 69–76.
