Выяснены особенности морфологической гетерогенности и метаморфоза каллусных тканей хлопчатника. Идентифицировануниверсальный для различных генотипов и морфогенетически стабильный при субкультивировании серовато-белый тип каллуса.
Ключевые слова: хлопчатник, каллусные ткани, эмбриогенные ткани.
The features of morphological heterogeneity and metamorphosis of cotton callus tissues have been clarified. The universal for different genotypes and stable during subculture morphogenetically grayish-white calli type was identified.
Keywords:cotton, callus tissue, embryogenic tissue.
Хлопчатник является важнейшей сельскохозяйственной культурой, имеющей экспортное значение [1]. Важной проблемой, сдерживающей разработку и широкое использование клеточных технологий для генетического улучшения хлопчатника, является существенная зависимость процесса регенерации растений в культуре тканей in vitro от исходного генотипа. Высокая способность к регенерации растений в культуре тканей хлопчатника ограничиваются, в основном, двумя — тремя сортами разновидности Coker, которые зачастую не являются коммерчески важными. В связи с этим, важной проблемой биотехнологий растений является разработка методов регенерации растений in vitro, пригодных для коммерчески ценных генотипов [2, 3]. В частности, проблема разработки клеточных технологий актуальна и для казахстанских сортов хлопчатника. Основной причиной, обуславливающей зависимость процессов регенераций от генотипа, является недостаток знаний о закономерностях процессов морфогенеза и регенерации растений универсальных для различных генотипов.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили районированные сорта хлопчатника казахстанской селекции — Мактаарал-4003, Мактаарал-4005, Мактаарал-4006, Мактаарал-4007, Мактаарал-4011, Мактаарал-4019, Пахтаарал-3044. При проведении экспериментов с культурой тканей руководствовались общими методическими приемами, описанными Ф. Л. Калининым с соавторами [4]. Постоянные гистологические препараты готовили по З. П. Паушевой [5]. Препараты изучали и фотографировали на микроскопе «Leika». Все эксперименты проводились в 3-х повторностях.
Результаты и обсуждения
В первичной культуре каллусов, полученных из семядолей и гипокотилей семи отечественных сортов хлопчатника, идентифицировано 3 типа тканей: I — серовато-белый рыхлый морфогенный; II — белый матовый плотный неморфогенный; III — бурый неморфогенный. Все типы первичных каллусов образовались через 35–45 дней культивирования эксплантов на среде Мурасиге и Скуга (МС) с 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л кинетина и 3 % сахарозы. Серовато-белый рыхлый морфогенный каллус (I тип) отобран нами для исследований, другие два типа первичных каллусов II и III типы оказались морфологически не перспективными. В процессе субкультивирования I типа ткани происходит метаморфоз первичного каллуса с образованием серовато-белого глобулярного морфогенного каллуса (IV тип) и полупрозрачного желтоватого рыхлого эмбриогенного каллуса (V тип). IV тип ткани получен при субкультивировании серовато-белых рыхлых каллусов I типа в течение двух пассажей (60–70 дней) на среде МС с удвоенной концентрацией макроэлементов, 1,0 мг/л 2,4-Д, 0,01 мг/л кинетина, 1000 мг/л гидролизата казеина (ГК), 500 мг/л пролина и 3 % мальтозы [6, 7]. Полупрозрачный желтоватый рыхлый эмбриогенный каллус (V тип) образуется при субкультивировании I типа ткани в течение 2-х последовательных пассажей (60–70 дней) на среде МС с удвоенной концентрацией КNO3 и 3 % мальтозы. В последующем из IV типа ткани получен матовый белый каллус (VI тип) и зеленый плотный эмбриогенный каллус (VII тип) при субкультивировании IV типа ткани в течение 35–40 дней на среде МС с 1,0 мг/л 2,4-Д, 0,01 мг/л кинетина, 1000мг/л гидролизата казеина (ГК), 500 мг/л пролина и 3 % мальтозы образуется матовый белый каллус (VI тип). Зеленые плотные эмбриогенные каллусы (VII типа) получены путем субкультивирования каллусов IV типа в течение двух пассажей согласно протоколу Kumria и др. [8]. Таким образом, выделен морфогенетически перспективный и универсальный для различных генотипов хлопчатника тип ткани — серовато-белый рыхлый каллус (I тип), который оказался отзывчивым на изменение состава питательной среды и способствовал получению различных морфологических типов тканей.
Изучение постоянных гистологических препаратов позволило выявить, что серовато-белый морфогенный каллус (I тип) в центральной части ткани состоит из плотно упакованных паренхимных клеток, на периферии — из обособленных друг от друга удлиненных клеток и клеток сферической формы. Каллус IV типа состоит из меристематических комплексов, крупных удлиненных и овальных каллусных клеток и одиночных округлых, компетентных к эмбриоидогенезу клеток. В IV типе каллуса имеются одиночные эмбриогенные клетки, проэмбриоиды не обнаружены, т. е. не происходит деление компетентных клеток. Рыхлые эмбриогенные полупрозрачные желтоватые каллусы (V тип) состоят из одиночных эмбриогенных клеток, 2-х, 3-х 4-х клеточных проэмбриоидов, предглобул, глобул. Матовый белый эмбриогенный каллус (VI тип) состоит из одиночных эмбриогенных клеток с общей каллозной оболочкой, 2-х, 3-х и 4-х клеточных проэмбриоидов, эмбриогенных клеточных комплексов (ЭКК), гигантских округлых и удлиненных каллусных клеток. Плотные эмбриогенные каллусы зеленого цвета (VII тип) состоят из ЭКК, удлиненных клеток, компетентных клеток и соматических зародышей на стадии инициации первых клеточных делений (проэмбриоиды). Таким образом, выяснены особенности морфологической гетерогенности каллусных тканей хлопчатника и идентифицирован наиболее стабильный и морфогенетически перспективный и универсальный для различных генотипов серовато-белый рыхлый тип каллуса (I тип).
Литература:
1. Умбетаев И. И. Технология возделывания отечественных сортов хлопчатника — Алматы. — 2005. — 235 с.
2. Smith R. H., Smith J. W., Park S. H. Cotton Transformation: Successes and Challenges / Liang G. H., Skinner D. Z. Genetically modified crops. Their development, uses and risks //Food Products Press, New York. — 2004. — P. 247–257.
3. Zapata C., Park S. H., El-Zik K. M., Smith R. H. Transformation of a Texas cotton cultivar by using Agrobacterium and the shoot apex //Theoretical and Applied Genetics, 1999. — V. 98. — P. 252–256.
4. Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растении. — Киев: Науково думка. — 1980. — 407с.
5. Паушева З. П. Практикум по цитологии растении — М.: «Агропромиздат».– 1988. — 272 с.
6. Амирова А. К., Бишимбаева Н. К. Влияние 2,4-Д на процесс соматического эмбриогенеза в длительно культивируемых каллусных тканях пшеницы //Биотехнология. Теория и практика, 2004. — № 3. — С.42–47.
7. Vasil I. K. Developing cell and tissue culture systems for the improvement of cereal and grass crops //J. Plant Physiol., 1987. — V. 128. — P. 193–218.
8. Kumria R., Sunnichan V. G., Das D. K., Gupta S. K., Reddy V. S., Bhatnagar R. K., Leelavathi S. High-frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum) through metabolic stress //Plant Cell Rep., 2003. — V. 21. — P. 635–639.
