Идентификация сортов озимой пшеницы устойчивых к Ptr ToxA возбудителя желтой пятнистости листьев с использованием ДНК-маркеров

Проведена идентификация гена устойчивости Tsn 1 к pyrenophora tritici-repentis у 23 сортов озимой пшеницы селекции КНИИСХ им. Лукьяненко и ВНИИЗК им. Калиненко с помощью ДНК-маркеров.

Ключевые слова: pyrenophora tritici-repentis, пшеница, ген устойчивости Tsn 1, молекулярный скрининг.

Identification of gene of resistance to pyrenophora tritici-repentis — Tsn 1 in 23 winter wheat varieties from Lukijanenko Krasnodar research institute of agriculture and Kalinenko All-Russian research institute of crops was maintained with the use of DNA-markers.

Keywords: pyrenophora tritici-repentis, wheat, resistance gene Tsn 1, molecular scrining

Северный Кавказ является зоной широкого возделывания озимой пшеницы. В последнее время возбудитель желтой пятнистости листьев занимает доминирующее положение среди листовых болезней пшеницы на данной территории [1- 3].

Специфичность взаимодействия патогена с растением обусловлена наличием определенных хозяин — специфичных токсинов, которые функционируют как факторы патогенности. Ptr ToxA — ответственен за развитие некрозов на чувствительных сортах пшеницы и является главным фактором патогенности [4- 5]. Ген ToxA, детерминирующий синтез токсина Ptr ToxA был клонирован и сиквенирован в 1997 году [6]. В настоящее время существует несколько кодоминантных SSR-маркеров, фланкирующих данный ген: Xfcp1, Xfcp2, Xfcp394, Xfcp393, Xfcp620 [7-8]. Канадские ученые показали, что устойчивость к патогену контролируется рецессивным геном tsn 1, который локализован на длинном плече хромосоме 5 BL.

В связи с сильной восприимчивостью высеваемых сортов на Северном Кавказе [2- 3] к данному патогену, необходимо проводить поиск источников новых доноров устойчивости к p. tritici-repentis. Использование молекулярно-генетических подходов в данном вопросе может способствовать ускорению селекционного процесса.

Цель данного исследования — идентифицировать сорта пшеницы, устойчивые к Ptr ТохА возбудителя желтой пятнистости листьев с использованием ДНК — маркеров.

Материалом исследований служили 23 сорта озимой пшеницы селекции КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко и ВНИИЗК им. И.Г. Калиненко, районированные и высеваемые на территории Северного Кавказа. Для идентификации носителей генов устойчивости использовали метод полимеразной цепной реакции. Выделение ДНК проведено на основе СТАВ метода [9].

Для идентификации носителей гена Tsn 1 проводилась ПЦР амплификация с использованием праймера Xfcp 1 R/F. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 2.5 мкл буфера, 1.0 мкл dNTP, 1,75мкл каждого праймера, 0,5 мкл Tag-полимеразы, 16 мкл Н₂О^//, 1,5 мкл ДНК. Для разделения фрагментов амплифицированной ДНК электрофорез осуществляли в 1,8 % агарозном геле. Амплификацию проводили при следующих параметрах: денатурация — 94⁰С в течении 4 минут; 45 циклов: 94⁰С -1 минута, 62⁰С — 1 минута; 72⁰С — 2 минуты; финальная элонгация — 72⁰С — 10 минут.

Электрофорез продуктов ПЦР отражает наличие или отсутствие в генотипах исследуемого образца искомого гена. В качестве положительного контроля при идентификации носителей генов использован сорт Glenlea, в котором идентифицирован ген устойчивости. Если в результате ПЦР амплифицируется фрагмент размером 374 п.н., считается, что в генотипе сорта содержится рецессивный аллель tsn 1 и сорт является устойчивым к токсину Ptr tox A. Если в результате ПЦР амплифицируется фрагмент размером 402 п.н., значит образец является носителем доминантного аллеля гена Tsn 1, восприимчивого к токсину Ptr tox A.

Результаты проведения ПЦР с праймером Xfcp1 у 23 сортов озимой пшеницы представлены в таблице 1. Отмечено наличие продукта амплификации 374 п.н. у 16 сортов, которые могут быть рассмотрены в качестве источников устойчивости к ТохА p. tritici-repentis для целенаправленной селекции сортов и гибридов пшеницы.

Таблица 1

Результаты идентификации сортов озимой пшеницы на устойчивые к Ptr ТохА возбудителя желтой пятнистости с использованием праймера Xfcp 1 R/F.

Литература:

1.      Кремнева О.Ю. Структура популяции возбудителя желтой пятнистости листьев пшеницы на Северном Кавказе по вирулентности и элементы биологизированной защиты от патогена: Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Кубанский государственный аграрный университет. Краснодар, 2007. — С. 78-84.

2.      Кремнева О. Ю. Желтая пятнистость листьев пшеницы на Северном Кавказе / О.Ю. Кремнева, Г.В. Волкова // Защита и карантин растений. 2011, № 10, — С. 37-40.

3.      Волкова Г. В., Кремнева О. Ю., Андронова А. Е., Надыкта В. Д. Желтая пятнистость листьев пшеницы (возбудитель Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler). Монография, Москва, ООО "АМА-ПРЕСС", 2012, — С. 62-82.

4.      Lamari L., Bernier C.C. Virulence of isolates of Pyrenophora tritici-repentis on 11 wheat cultivars and cytology of the different host reaction // Can. J. Plant Pathol. 1989. Vol. 11. P. 284−290.

5.      Ballance G. M., Lamari L., Bernier C.C. Purification and characterization of a host-selective necrosis toxin from Pyrenophora tritici-repentis // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1989. Vol. 35. P. 203–213.

6.      Ballance G.M., Lamari L., Kowatsch R., Bernier C.C. Cloning, expression and occurrence of the gene encoding the Ptr necrosis gene encoding the Ptr necrosis toxin from Pyrenophora tritici-repentis // Mol. Plant Pathol., 1996, http://www.bspp.org.uk/mppol/1996/1209ballance/.

7.      Ali S., Gurung S., and Adhikari T. B. Identification and characterization of novel isolates of Pyrenophora tritici-repentis from Arkansas // Plant Dis. 2010. Vol. 94. P. 229−235.

8.      Grow A., Johnson H. Simulating pathogen population shifts of Pyrenophora tritici-repentis on Canadian wheat cultivars points to potential risks of PtrToxB // Canad. J. Plant Breeding. 2013. Vol. 1, N 1. P. 27-38.

9.      Murray H. G., Thompson W. F. Rapid isolation of high molecular weight DNA // Nucleilc Acids Res. 1980. Vol. 8. P. 4321−4325.

10.  Остерман, Л.А. 1981 Методы исследования нуклеиновых кислот.- М.: Наука, 1981. — 288 с.