Применение SSR и REMAP маркеров в генотипировании сортов сливы домашней

В данной работе представлены результаты апробации новых REMAPмаркеров для генотипирования сортов сливы домашней и отечественной и зарубежной селекции, а также результаты генотипирования по 2 SSRмаркерам, проявившим более высокий уровень полиморфизма в сравнении с апробированными REMAPмаркерами.

Ключевые слова: слива домашняя, ДНК-маркеры, REMAP, SSR

In this work presents the results of genotyping varieties of European plum domestic and foreign selection with use new REMAP markers, as well as the results of genotyping 2 SSR markers who have demonstrated a higher level of polymorphism in comparison with proven REMAP markers.

Keywords:European plum, DNA markers, REMAP, SSR

Для современной селекции плодовых культур актуально внедрение практики использования молекулярных маркеров как на этапе оценки генресурсов, так и последующего селекционного отбора гибридных форм. К одним из наиболее перспективных локус-специфичных ДНК-маркерам относят микросателлитные маркеры (SSR). Среди мультилокусных маркеров выделяется маркерные системы, основанные на полиморфизме транспозонных вставок в геном. В частности REMAP маркер позволяет проводить анализ полиморфизма участков генома расположенных между вставками транспозонов и микросателлитными последовательностями. Целью данной работы является разработка REMAP маркеров для генотипирования сортов сливы домашней и сопоставление результатов REMAP и SSR генотипирования.

Методы и материалы. Материалом исследования послужили 8 сортов сливы домашней отечественной и зарубежной селекции: Краснодарская, Ренклод Альтана, Герцог, Кубанский карлик, Подруга, Милена, Кабардинская ранняя, Стэнлей. Экстракция ДНК проводилась с использованием СТАВ-метода.

SSR- генотипирование. В состав ПЦР смеси входили 50 нг ДНК, 0,25мМ dNTPs, 0,2 µМ каждого праймера; 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера, 1 единица Taq-полимеразы, в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. ПЦР-программу проводили по следующей схеме: 3 мин. при 94ºС, 35 циклов: 45 с. при 94ºС, 45 с. при 58ºС, 45 с. при 72ºС; последний цикл 4 мин. 30 с. при 72ºС. Анализ размеров амплифицированных фрагментов проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI prism 3130.

REMAP-генотипирование. Концентрация компонентов ПЦР-смеси: 1Х буфер, 2,5 мМ dNTP, 3 mM MgCl2, 0,75 mM IRAP праймера (Сass2) и 0,75 mM ISSR праймера, 1 ед. ДНК-полимеразы, 20 нг ДНК на одну реакцию. Параметры проведения ПЦР по REMAP маркерам: 3 мин. при 94ºС; 20 циклов включающие следующие этапы: 40 с. при 94ºС, 40 с. при 50ºС в первом цикле с последующим увеличением температуры на 0,5ºC в каждом новом цикле, 2 мин. при 72ºС; 16 циклов включающие следующие этапы: 40 с. при 94ºС, секунд при 60ºС, 2 минуты при 72ºС; последний цикл 5 мин. при 72ºС. Электрофорез проводили в 2 % агарозном геле в течении 1 часа при напряжении 120 вольт. Визуализация продуктов проводилась бромистым этидием в ультрафиолете.

Результаты. На основе полиморфного IRAP маркера Cass2, были разработаны REMAP маркеры, включающие ISSR маркеры UBC 864, UBC 849 и UBC 841. Комбинации праймеров Сass2 + UBC 864 и Сass2 + UBC 849 дали четкие, однако, мономорфные продукты амплификации у изученных восьми сортов сливы домашней (Рисунок). При проведении генотипирования по маркеру Сass2 + UBC 841 было выявлено большое количество фрагментов, включая ряд минорных компонентов, что существенно снижает перспективность его дальнейшего использования. Таким образом, необходимо продолжение апробации различных комбинаций праймера Cass2

Рис. 1. Генотипирование cортов сливы домашней по маркеру Сass2 + UBC 864

Условные обозначения: М — маркер молекулярного веса, 1-8 — сорта сливы домашней.

SSR-генотипирование сортов сливы домашней выполнили по 2 SSR маркерам, сгруппированным в мультиплексный набор. При общем анализе аллельного состава по исследуемым SSR-локусам у приведенных сортов сливы обнаружилось, что каждый из сортов обладает индивидуальным набором аллелей по каждому маркеру.

Диапазоны размеров аллелей соответствуют литературными данными. Оба SSR маркера, объединенных в мультиплексный набор, показали высокий уровень полиморфизма на сортах сливы домашней. Для более точной интерпретации полученных сведений по полиморфизму SSR локусов необходимо увеличить выборку сортов.

Таблица 1

Микросателлитные ДНК-профили изученных сортов сливы домашней (размеры аллелей указаны в парах нуклеотидов)

Выводы. Таким образом, высокий уровень полиморфизма выявленный в ходе SSR-генотипирования свидетельствуют о эффективности применения использованных в работе SSR-маркеров. Тем не менее, для проведения результативного REMAP-генотипирования требуется продолжить поиск полиморфных маркеров позволяющих однозначно и достоверно интерпретировать полученные результаты.