Огромное количество микроорганизмов колонизируют человеческий организм. В совокупности все микроорганизмы, обитающие на человеческом теле, называют микробиомом. Влияние микробиома на жизнедеятельность хозяина огромно, однако классический микробиологический посев не способен корректно сохранить соотношение и выявить все обитающие на коже микроорганизмы. С появлением методов секвенирования следующего поколения такие исследования были проведены не только для здоровых людей, но для пациентов страдающих различными заболеваниями. В этом обзоре рассмотрены изменения в микробном разнообразии кожи в контексте атопического дерматита, псориаза, хронических ран и других повреждений кожи. Проанализировано воздействие современного образа жизни на микробиом человеческой кожи. Содержится анализ человеческого микробиома кожи, его взаимодействие с иммунной системой хозяина и другими микроорганизмами, имеющихся на кожной поверхности. Приводятся данные о механизмах развития болезней кожи, рассматриваются также имеющиеся потенциальные стратегии в терапии различных кожных заболеваний. Раскрываются механизмы, задействованные в развитии болезней кожи.
Ключевые слова: микробиом, метагеномные исследования, секвенирование.
Введение.
Многие биологические процессы в организме человека связаны с микроорганизмами, колонизирующими тело человека (микробиом) [1, 2]. В среднем на коже здорового человека имеется 1014 микроорганизмов, что в 10 раз больше количества собственных клеток организма [1, 3]. Это бактерии, дрожжи, бактериофаги и вирусы, а также эукариотические организмы, участвующие в формировании иммунитета и усвоении питательных веществ [4, 5].
Подробное изучение микробиома человека началось сравнительно недавно, причём наиболее широко изученным оказался микробиом пищеварительного тракта [3, 4]. Пищеварительный тракт человека содержит почти 10 триллионов бактериальных клеток и более 2000 бактериальных видов [6]. Особенности питания, окружающая среда и генетические факторы влияют на состав микробного сообщества пищеварительного тракта, а оно, в свою очередь, связано с воспалительными заболеваниями, злокачественными опухолями ободочной и прямой кишки, клостридиальными инфекциями, а также системными расстройствами, включающими беспокойство, депрессию, ожирение и диабет [7–9].
Бактериальные сообщества кожи значительно различаются в зависимости от локализации на теле, влияния температуры, pH фактора и содержания кислорода [10]. Несмотря на то, что поверхность кожи не оптимальна для микробного роста (является прохладной и кислой), примерно 1 миллиард бактерий обитает на поверхности её одного квадратного сантиметра (Рис. 1) [11].
Рис. 1. Микробиологическое разнообразие человека [10]
Эти разнообразные микробные сообщества создают определённые экологические ниши, которые могут помочь в профилактике болезней или способствовать их развитию [1]. Например, некоторые бактерии ограничивают рост других микроорганизмов, гидролизуя липиды кожного жира в яд [12]. Такой механизм ограничивает развитие таких условно патогенных бактерий как Staphylococcus aureus [12, 13]. В тоже время, значительные изменения в составе микробного сообщества кожи связаны с неинфекционными заболеваниями, например с атопическим дерматитом, псориазом и угревой сыпью [11]. Изменения в структуре бактериального сообщества в сочетании с эпителиальной дисфункцией, иммунной дисрегуляцией, или чрезмерным ростом патогенных микроорганизмов лежат в основе патологий кожи [14].
Современные методы исследования микробиома.
В 2008 г. в Национальном Институте Здоровья США (US National Institutes of Health), стартовал проект по изучению микробиома кожи «здоровых» волонтёров [5]. Этот проект впервые позволил «увидеть», как выглядит микробиом «здорового» человека [5, 10]. Для контроля изменений в бактериальных сообществах на поверхности кожи, группы исследователей, разработали обширный план эксперимента.
При планировании метагеномных исследований необходимо понять, какие методы лучше всего подходят для целей проекта и способны ли они предоставить данные, сопоставимые с ранее полученными результатами. Перед началом исследований были предусмотрены несколько важных моментов, таких как предотвращение контаминацией «природной» ДНК, обеспечение хранения образцов, учёт влияние на образцы персонала. Для защиты от контаминации использовалось стерильное оборудование и реактивы. Забор материала осуществляли с помощью смыва, соскоба или биопсии. Смыв или соскоб более просты в выполнении и могут быть проделаны на большем количестве испытуемых, но только с помощью биопсии возможен сбор подкожных микроорганизмов.
Как только образцы получены и качественно сохранены, из них выделяют ДНК. При использовании биопсии образец содержит значительное количество клеток ткани хозяина, поэтому в этом случае используют методы, ограничивающие количество ДНК хозяина и обеспечивающие максимальное присутствие ДНК микрофлоры для последующего секвенирования [21].
После выделения суммарной ДНК различных микроорганизмов определяют оптимальную стратегию исследования. Например, бактериальные сообщества оценивают, амплифицируя вариабельную область консервативного 16S рибосомного гена, в то время как для грибов исследуют последовательность 18S РНК рибосомального гена или внутренней межгенной области (спейсера).
Подходы с использованием «частичного» секвенирования не требуют культивирования, сотни образцов могут быть проанализированы за один запуск полногеномного секвенатора [22–24].
Альтернативный подход включает в себя секвенирование множества случайных фрагментов ДНК (shotgun sequencing). В этом случае время проведения исследования и сложность биоинформатической обработки значительно возрастает, хотя и количество полученных данных значительно большее [39, 40]. Технологии секвенирования Roche 454, Illumina, Ion Torrent и Pacific Biosciences значительно отличаются, что необходимо учитывать [27, 28]. После секвенирования, анализируют разнообразие бактериальных последовательностей и количество данных, оценивают достигнутую глубину и покрытие секвенирования.
Для анализа данных о микробиоме, полученных с использованием секвенирования второго поколения, существуют специальные программы, такие как QIIME, Mothur и MetaPhlAn. Другие программы MEGAN, Krona, MGAviewer и MetaSee созданы для визуализации данных (Рис. 2) [41–46].
Независимо от используемого метода секвенирования, самый трудоёмкий и длительный этап анализа микробиома — это бионформатическая обработка полученных данных. Для анализа данных используют крупные компьютерные кластеры. Они упорядочивают и выравнивают между собой миллионы последовательностей ДНК [15]. В процессе работы для специфических и новых задач может возникнуть потребность в новых биоинформатических скриптах для создания которых потребуется участие программиста [36].
Рис. 2. Этапы анализа микробиома (А — сборка первичных данных, Б — сборка контигов, В — филогенетический анализ) [39]
Микробиом кожи здорового человека.
После появления всех инструментов, необходимых для исследования микробиома, Greis et al. [22] охарактеризовали топографическое и временное разнообразие микробиома кожи «здорового» взрослого человека. Исследователи ожидали, что Staphylococcus будет преобладать, однако полученные данные были другими. В результате исследования обнаружено 19 основных типов, но на коже, в основном, представлены: Actinobacteria (52 %), Firmicutes (24 %), Proteobacteria (17 %) и Bacteroidetes (7 %). Анализируя полученные данные авторы определили, что разновидности Propionibacterium и Staphylococcus доминируют на участках кожи с большей жирностью (крыловидная складка, внешний слуховой канал, затылок). На более влажных участках преобладают разновидности Corynebacterium (подмышечная область, межпальцевое пространство, паховая область, подколенная ямка, подошвенная область, пяточная область, пупочная область), там же выявлены представители Staphylococcus. В сухих местах, таких как ладони, предплечье, ягодицы проживает смешанная популяция бактерий [20]. Дополнительные исследования демонстрируют, что физиологически сопоставимые места населены подобными микробными сообществами, например, влажные подмышечные впадины и подколенные ямки имеют схожий микробный состав [10]. Микроорганизмы «привязаны» к текущему участку тела. Микроорганизмы, пересаженные из одной среды обитания в другую, например, с языка на лоб, не способны колонизировать новую территорию или изменить существующее в этой области микробное сообщество [10].
Эмбриональная кожа стерильна в утробе матери, поэтому процесс её колонизации начинается в момент рождения [21]. Вагинальные микроорганизмы преимущественно видов Lactobacillus, Prevotella или Sneathia немедленно покрывают кожу естественно новорождённых, в то время как микробиом кожи новорождённых с применением кесарева сечения больше напоминает микробиом взрослой кожи содержащий Staphylococcus, Corynebacterium и Propionibacterium [22]. Независимо от способа доставки микробиом новорождённой кожи значительно менее сложен по сравнению с микробиомом кожи взрослого человека. Изменённое биоразнообразие оказывает значительное влияние на иммунную систему и организм в целом, способствуя развитию ряда заболеваний, некоторые из которых рассмотрены ниже.
Атопический дерматит.
Классический атопический дерматит локализуется на конкретных участках кожи: шея, подмышечные впадины, локтевые и подколенные ямки и другие участки кожи. Микроорганизмы, обитающие на коже в этих участках сходны [10].
Kong et al. [25], определили, что в более чем 90 % случаев при атопическом дерматите происходит колонизация кожиStaphylococcus. aureus, причём колонизации подвержены не только поражённые участки, но и участки здоровой кожи. В группе «здоровых» количество S. aureus было на 5 % меньше. В местах поражения обнаружена взаимосвязь между количеством S. aureus и стадией заболевания. Авторы предположили, что потеря биоразнообразия микробиома связана с патогенезом атопического дерматита.
Другие исследователи выявили увеличение грибкового разнообразия и наличие уникальных анаэробных разновидностей, в основном Clostridium и Serratia при атопическом дерматите [26]. Эти исследования помогают в выборе оптимальной терапии, уменьшающей «микробную нагрузку». Кроме того, при исследовании микробиомов кишечного тракта у детей страдающих атопическим дерматитом выявлена их и большая схожесть с микробиомом взрослого человека, например, выявлено трёхкратное уменьшение количества Bacteriodetes и колонизация Clostridium clusters IV и XIVa [27].
Псориаз.
Обычно псориаз описывают как заболевание аутоиммунной природы, но влияние микроорганизмов на его патогенез рассматривают, начиная с 1950 г. [1]. В 1955 г. была обнаружена взаимосвязь между заболеванием верхних дыхательных путей вызванным бетагемолитическим стрептококкам группы А и возникновением пятнистого псориаза [28]. Однако, антистрептококковая терапия или удаление поражённых стрептококком тканей не привели к успеху, оставив открытым вопрос о взаимосвязи между микробным сообществом и псориазом [29].
Fahlén et al. [30] изучили взаимосвязь между бактериальными видами, обитающими на коже и псориазом. В исследовании участвовали 10 пациентов с псориазом, контрольная группа состояла из 12 человек. Обнаружено, что в группе больных псориазом в большем количестве присутствовали протеобактерии. Кроме того, в очагах поражений также обнаружены в больших количествах Streptococcus и Propionibacterium, чем на здоровых участках кожи. В целом бактериальное биоразнообразие у больных псориазом меньше, но различия по сравнению с контрольной группой не значительны [30].
В результате дальнейших исследований было выделено три микробные совокупности, связанные с псориазом [31]. На коже больных доминировали протеобактерии, актинобактерии и фирмикуты. Хотя авторам не удалось выявить определённого этиологического бактериального агента, их результаты продемонстрировали, что биоразнообразие кожи на её здоровых участках больше чем на участках, поражённых псориазом, при этом грибковое и вирусное биоразнообразие не было исследовано. Механизмы появления этих изменённых микробных сообществ остаются не ясными, предполагается, что задействованы индивидуальные генетические и иммунные факторы, определяющие уникальность бактериального сообщества кожи.
Угревая сыпь.
Этиология и патогенез угревой сыпи остаются неизвестными, но предполагается, что участие микроорганизмов является одним из основных факторов, способствующим развитию этой болезни [1]. Вид Propionibacterium acnes долгое время рассматривался как важный фактор при угревой сыпи. Предполагается, что продукция Propionibacterium acnes липаз, протеаз и гиалуронидаз играет важную роль в развитии угревой сыпи [32]. Однако Propionibacterium описаны как бактерии комменсалы, обитающие на коже [10]. Для выявления различий между комменсальными и патогенными штаммами P. acnes, Fitz-Gibbon et al. [33] исследовали угри в области носа у 2 пациентов, используя для сравнения группу условно здоровых. Хотя количество P. acnes в обеих группах было одинаковое и авторы не исследовали воспалённые фолликулы, было установлено, что штаммы P. acnes в группе больных и группе «здоровых» отличаются. Шесть различных штаммов были представлены в группе с угревой сыпью и только один штамм в контрольной группе. Также в этом исследовании определили гены антибиотикоустойчивости у штаммов P. acnes, ассоциированных с болезнью [34]. Таким образом, исследователями подчёркнута важность терапии с применением антибиотиков. В другом исследовании, авторы исследовали микрофлору кожи при угревой сыпи с помощью секвенирования 16S рРНК. Была отмечена колонизация воспалённых фолликул не только P. acnes, но и многочисленными другими бактериальными видами, которые также описывают как комменсалов, например Streptococcus epidermidis, при этом в группе условно здоровых обнаружили только P. acnes [35]. Эти исследования демонстрируют, что микроорганизмы комменсалы могут участвовать в процессе патогенеза, например, за счёт генетических изменений, или через взаимодействие с другими видами бактерий.
Хронические раны.
Хроническая рана это рана, не заживающая в течение длительного времени, например, дольше чем 3 месяца. Бактерии могут не быть причиной возникновения раны, однако вторичная инфекция мешает заживлению [32]. Существуют несколько исследований микробных сообществ из хронических ран и язв диабетиков [36–38]. Исследования показали, что из хронических ран, выделяются разновидности Staphylococcus, Serratia и Clostridium [37]. Грибы, простейшие и вирусы, также выявлены в хронических ранах [38]. Эти исследования демонстрируют, что при повреждении кожи возникает колонизация раны оппортунистической инфекцией. Хотя бактериальные инфекции положительно отвечают на терапию антибиотиками, выявление грибковых и вирусных инфекций подразумевает, что подход к выбору терапии должен быть многосторонним.
Заключение.
Современный образ жизни: питание, применение антибиотиков, постоянно изменяют микробиом человека. Классический микробиологический посев не позволяет выявить всю сложность микробиома человека, вследствие разнообразия обитающих на коже микроорганизмов, например, бактериофагов. Полноценные исследования микробиома стали возможными только после появления методов секвенирования второго поколения являющимися достаточно сложным видом исследований из-за сложной биоинформатической обработки данных.
В современном обществе процесс передачи микробиома от матери к новорождённому ребёнку периодически нарушается из-за повсеместного применения кесарева сечения. Это приводит к изменениям в формировании иммунной системы новорождённого, что возможно, закладывает предпосылки для развития целого ряда патологий в будущем. Таким образом, существует взаимосвязь между микробиомом, иммунной системой и патологией. Исследование этой взаимосвязи позволит лучше понять механизмы, лежащие в основе того или иного заболевания, что в конечном счёте повлияет на качество терапии кожных заболеваний.
Литература:
1. Weyrich LS1, Dixit S, Farrer AG, Cooper AJ, Cooper AJ. The skin microbiome: Associations between altered microbial communities and disease. Australas J Dermatol. 2015 Feb 25. doi: 10.1111/ajd.12253.
2. Venter JC, Adams MD, Myers EW et al. The sequence of the human genome. Science 2001; 291: 1304–51.
3. Wilson M. Bacteriology of Humans: an Ecological Perspective. Oxford: John Wiley & Sons, 2009.
4. Costello EK, Stagaman K, Dethlefsen L et al. The application of ecological theory toward an understanding of the human microbiome. Science 2012; 336: 1255–62.
5. Consortium THMP. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 2012; 486: 207–14.
6. Savage DC. Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Annu. Rev. Microbiol. 1977; 31: 107–33.
7. Kinross JM, Darzi AW, Nicholson JK. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome. Med. 2011; 3: 14.
8. Cho I, Blaser MJ. The human microbiome: at the interface of health and disease. Nat. Rev. Genet. 2012; 13: 260–70.
9. Hsiao EY, McBride SW, Hsien S et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 2013; 155: 1451–63.
10. Costello EK, Lauber CL, Hamady M et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science 2009; 326: 1694–7.
11. Grice EA, Segre JA. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 2011; 9: 244–53.
12. Puhvel SM, Reisner RM, Sakamoto M. Analysis of lipid composition of isolated human sebaceous gland homogenates after incubation with cutaneous bacteria. Thin-layer chromatography. J. Invest. Dermatol. 1975; 64: 406–11.
13. Ulrich RG. Evolving superantigens of Staphylococcus aureus. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000; 27: 1–7.
14. Kong HH, Segre JA. Skin microbiome: looking back to move forward. J. Invest. Dermatol. 2012; 132: 933–9.
15. Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75: 7537–41.
16. Segata N, Waldron L, Ballarini A et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nat. Methods 2012; 9: 811–4.
17. Huson DH, Auch AF, Qi J et al. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome Res. 2007; 17: 377–86.
18. Ondov BD, Bergman NH, Phillippy AM. Interactive metagenomic visualization in a web browser. BMC Bioinformatics 2011; 12: 385.
19. Zhu Z, Niu B, Chen J et al. MGAviewer: a desktop visualization tool for analysis of metagenomics alignment data. Bioinformatics 2013; 29: 122–3.
20. Grice EA, Kong HH, Conlan S et al. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science 2009; 324: 1190–2.
21. Costello EK, Carlisle EM, Bik EM et al. Microbiome assembly across multiple body sites in low-birthweight infants. MBio 2013; 4: e00782–13.
22. Dominguez-Bello MG, Costello EK, Contreras M et al. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial microbiota across multiple body habitats in newborns. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010; 107: 11971–5.
23. Leyden JJ, McGinley KJ, Mills OH et al. Age-related changes in the resident bacterial flora of the human face. J. Invest. Dermatol. 1975; 65: 379–81.
24. Meadow JF, Bateman AC, Herkert KM et al. Significant changes in the skin microbiome mediated by the sport of roller derby. PeerJ 2013; 1: e53.
25. Kong HH, Oh J, Deming C et al. Temporal shifts in the skin microbiome associated with disease flares and treatment in children with atopic dermatitis. Genome Res. 2012; 22: 850–9.
26. Oh J, Freeman AF, Park M et al. The altered landscape of the human skin microbiome in patients with primary immunodeficiencies. Genome Res. 2013; 23: 2103–14.
27. Nylund L, Satokari R, Nikkilä J et al. Microarray analysis reveals marked intestinal microbiota aberrancy in infants having eczema compared to healthy children in at-risk for atopic disease. BMC Microbiol. 2013; 13: 12.
28. Norrlind R. Significance of infections in origin of psoriasis. Acta Rheumatol. Scan. 1955; 1: 135–44.
29. Owen CM, Chalmers RJ, O’Sullivan T et al. Antistreptococcal interventions for guttate and chronic plaque psoriasis. Cochrane Database Syst. Rev. 2000; (2): CD001976.
30. Fahlén A, Engstrand L, Baker BS et al. Comparison of bacterial microbiota in skin biopsies from normal and psoriatic skin. Arch. Dermatol. Res. 2012; 304: 15–22.
31. Statnikov A, Alekseyenko AV, Li Z et al. Microbiomic signatures of psoriasis: feasibility and methodology comparison. Sci. Rep. 2013; 3: 2620.
32. McKelvey K, Xue M, Whitmont K et al. Potential anti-inflammatory treatments for chronic wounds. Wound. Pract. Res. 2012; 20: 86–9.
33. Fitz-Gibbon S, Tomida S, Chiu B-H et al. Propionibacterium acnes strain populations in the human skin microbiome associated with acne. J. Invest. Dermatol. 2013; 133: 2152–60.
34. Eady EA, Layton AM. A distinct acne microbiome: fact or fiction? J. Invest. Dermatol. 2013; 133: 2294–5.
35. Bek-Thomsen M, Lomholt HB, Kilian M. Acne is not associated with yet-uncultured bacteria. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 3355–60.
36. Price LB, Liu CM, Melendez JH et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rRNA gene-based pyrosequencing: impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS ONE 2009; 4: e6462.
37. Gontcharova V, Youn E, Sun Y et al. A comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiol. J. 2010; 4: 8–19.
38. Wolcott RD, Gontcharova V, Sun Y et al. Evaluation of the bacterial diversity among and within individual venous leg ulcers using bacterial tag-encoded FLX and titanium amplicon pyrosequencing and metagenomic approaches. BMC Microbiol. 2009; 9: 226.
39. Liu Z, Lozupone C, Hamady M et al. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 2007; 35: e120.
40. Shakya M, Quince C, Campbell JH et al. Comparative metagenomic and rRNA microbial diversity characterization using archaeal and bacterial synthetic communities. Environ. Microbiol. 2013; 15: 1882–99.
41. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods 2010; 7: 335–6.
42. Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75: 7537–41.
43. Segata N, Waldron L, Ballarini A et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nat. Methods 2012; 9: 811–4.
44. Huson DH, Auch AF, Qi J et al. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome Res. 2007; 17: 377–86.
45. Ondov BD, Bergman NH, Phillippy AM. Interactive metagenomic visualization in a web browser. BMC Bioinformatics 2011; 12: 385.
46. Zhu Z, Niu B, Chen J et al. MGAviewer: a desktop visualization tool for analysis of metagenomics alignment data. Bioinformatics 2013; 29: 122–3.
