Генотоксичность и оксидательный стресс, индуцированный при сочетанном воздействии шестивалентного хрома и гамма-облучения



Нестабильность генетического материала клетки, возникающая под воздействием радиационного загрязнения окружающей среды, возрастающего использования источников ионизирующего излучения в промышленности и медицине, может выступать причиной усиления процесса при дополнительной генотоксической нагрузке. Особую актуальность эта проблема приобретает в биогеохимических провинциях, так как оценка токсичности, канцерогенности, и мутагенности любого физического, химического или биологического агента фактически является изучением комбинированных воздействий [1, c. 414]. Экопатогенный риск в Западном Казахстане связан с наличием хромо–борной биогеохимической провинции, и региональной особенностью обеспечения радиационной безопасности (мощность экспозиционной дозы и средняя годовая эффективная доза внешнего облучения населения выше среднереспубликанских показателей) [2, c.11–12; 3, c.13], и эффект взаимодействия мутагенных и генотоксических факторов могут приводить к неожиданномуи непоправимому ущербу для здоровья человека и его потомков [4, c.549; 5, c.75–76].

Исходя из вышеизложенных, целью нашей работы являлось изучение связи между уровнем цитогенетических нарушений и интенсивностью окислительного стресса при сочетанном воздействии бихромата калия и фракционного гамма облучении.

Методика. Исследования проводили на нелинейных белых крысах — самцах массой 190–220г, полученных из вивария Центральной научно–исследовательской лаборатории ЗКГМУ (г. Актобе, Казахстан), которые содержались при естественной освещенности и максимальной стандартизации температурного и пищевого режимов со свободным доступом к еде и воде. Все манипуляции были проведены в соответствие с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986). Протокол эксперимента был разработан при участии и одобрении этической комиссии вуза.

Животные были разделены на 3 группы. Первая группа — контрольная, вторая — подвергалась фракционному гамма облучению в течение 5 дней (0,6 Гр/сут; мощность дозы 1 Гр/мин; ⁶⁰Co). Суммарная доза составила 3 Гр. Третья — подвергалась сочетанному воздействию фракционного гамма излучения (как во II — группе) и бихромата калия (Cr⁺⁶). Бихромат калия вводили внутрибрюшинно ежедневно в дозе 2,8 мг/кг массы тела (0,1 LD₅₀) в течение 5 дней. Забой через 24 часа.

Для оценки мутагенной активности использовали метод микроядерного анализа, основанного на учете частоты микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга грызунов [6, c.1082; 7, c.9]. Интенсивность оксидативного стресса клетках костного мозга оценивали по уровню малоновогодиальдегида (МДА) — конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) [8, c. 8–10].

В комплекс исследования, позволяющего судить об интенсивности липопероксидации и мощности антиоксидантной защиты (АОЗ) в крови входило определение содержания диеновых конъюгатов (ДК) [9, c.679; 10, c.33], уровня МДА [8, c.8] активности каталазы (КАТ) [11, c.16], концентрации сульфгидрильных групп (SH — групп) с применением реактива Эльмана [12, c.225], уровня молекул средней массы (МСМ) [13, c.13], вычисление соотношения SH/МДА — интегрального показателя сбалансированности перекисного гомеостаза [14, c.232]. Количество общих липидов определяли с помощью набора «Лахема», белка — по методу Lowry [15, c.265]. Статистическую обработку полученных данных проводили методами математической статистики с использованием критерия t — Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждения. Анализ данных окислительного метаболизма в крови, сформировавшегося при фракционном гамма–облучении показывает, что при многократном γ — облучении происходит интенсификация процессов ПОЛ в плазме крови: увеличение содержания ДК в 1,6 раза, МДА в 1,80 раза. Изменяется состояния системы АОЗ — повышается активность КАТ на 26 % на фоне снижения уровня SH–групп на 23 %. Продукция МСМ возрастает на 31 %. Установленные накопления ДК, МДА, высокая активность КАТ и продукции МСМ, вероятно, отражает напряжение в адаптационных возможностях на уровне целостного организма. Известно, что КАТ способствует инактивации перекиси водорода, образующей в реакции дисмутации O₂ под действием супероксиддисмутазы. В данном случае КАТ участвует в обезвреживании АФК в начальной стадии ПОЛ. Уменьшение SH–групп в крови, по-видимому, отражает ограничение адаптивных возможностей организма. Об этом свидетельствует и снижение интегрального показателя SH/МДА плазмы крови на 54 %.

В условиях сочетанного воздействия фракционного гамма облучения и шестивалентного хрома (Cr⁺⁶) состояния системы ПОЛ–АОЗ усугубляется еще в большей степени. Так, содержание ДК и МДА увеличивается соответственно в 4,0 и 4,2 раза, продукция МСМ повышается в 2,0 раза на фоне падения активности КАТ на 34 %, содержание тиоловых групп на 49 % (в 2 раза), что приводит к снижению соотношения SH/МДА в 4,5 раза по сравнению с данными животных контрольной группы, в 2,1 раза в сравнении с показателями животных, подвергнутых изолированного фракционному гамма облучению и характеризуют степень нарушений сбалансированности перекисного гомеостаза на уровне целостного организма. Следовательно, эффект от сочетанного воздействия более 2-х раза превышает результаты ПОЛ–АОЗ изолированного многократного гамма облучения.

Результаты микроядерного тестирования показали, что спонтанная частота МЯ в ПХЭ костного мозга у контрольных крыс составляет 4,620,36‰. Через 24 часа после последнего сеанса фракционного гамма облучения частота МЯ в ПХЭ костного мозга увеличивается до 12,30,90‰, что превышает в 2,6 раза контрольные значения. Сочетанное воздействие фракционного гамма облучения и бихромата калия приводит к существенным изменениям показателей по сравнению с изолированным гамма облучением: частота МЯ в ПХЭ костного мозга возрастает в 7,9 раза, что превышает данные изолированного воздействия радиации в 3,0 раза и свидетельствует о более глубоком генотоксическом поражении.

Изучение уровня МДА — маркера интенсивности ПОЛ, определяющего степень выраженности оксидативного стресса в клетках костного мозга позволило установить увеличении МДА при гамма облучении в 4,25 раза в сравнении с данными животных контрольной группы. В условиях сочетанного воздействия бихромата калия и фракционного гамма облучения уровень МДА повышается в 8,5 раза по сравнению с контролем и в 2,0 раза в сравнении с данными изолированного влияния радиации.

Таким образом, полученные нами данные микроядерного тестирования позволяют сделать вывод о генотоксическом и мембранотоксическом эффектах исследуемых агентов, усугубляющихся при сочетанном воздействий. Вероятен существенный вклад в реализации этих процессов механизмов окислительного стресса, запускаемых при действии супрафизиологических концентрации шестивалентного хрома. Попав внутрь клетки Cr⁺⁶ восстанавливается до Cr⁺³, что сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК) и индуцирует поврежденииклеточных структур, в том числе генетических [16, с.33–34; 17, с.311; 18, с.39]. И, наконец, развитие смешанного ацидоза и гипоксии смешанного типаустановленных нами ранее при хромовой интоксикации [16, с.33], запуская в макрофагах эритробластных островков костного мозга «активацию» дыхательного взрыва становитсяисточником свободных радикалов и других мутагенных продуктов, вызывающих повреждение генома эритробластов. Одновременно при гипоксии любого генеза в организме повышается уровень стимуляторов эритропоэза — эритропоэтина и андрогенов, что уменьшает время восстановления первичных повреждений ДНК [19, с.67]. Под действием радиации также активизируется свободнорадикальное окисления, нарушается деятельность быстро обновляющихся тканей, в частности системы кроветворения и желудочно-кишечного тракта, выработка антиоксидантных факторов этими органами подавляется, и устойчивость экспериментальных животных резко снижается [20, с.154]. Совокупность вышеизложенных механизмов сочетанного воздействия определяют тяжесть и степень окислительного метаболизма, уровень генотоксичности, следовательно, адаптивные возможности организма.

Литература:

1. Ярмоненко С. П., Вайнсон А. А. Радиобиология человека и животных: Учебное пособие. — М.: «Высш.шк»., 2004. — 549 с.
2. Изтлеуов М. К., Изтлеуов Е. М. Экология и здоровье // Медицинский журнал Западного Казахстана. — 2006. — 2 (10). — с. 8–16.
3. Кибатаев К. М., Мутигулина Г. А., Еламан Б. К., Мамырбаев А. А., Мадихан Ж. Ш., Мануков В. Г. Дозы внешнего облучения населения Актюбинской области от естественных источников ионизирующей радиации // Медицинский журнал Западного Казахстана. — 2015. — 3(47). — с. 12–14.
4. Бочков Н. П., Чеботарев А. Н., Катосова Л. Д., Платонова В. И. База данных для анализа количественных характеристик частоты хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови человека // Генетика. — 2001. — Т.37, № 4. — с. 549–557.
5. Фрейдин М. Б., Васильева Е. О., Скобельская Е. В., Гончарова И. А., Карпов А.Б, Тахауов Р. М. Частота и спектр хромосомных аберраций у работников Сибирского химического комбината // Бюллетень сибирской медицины. — 2005. — № 2. — с. 75–82.
6. Журков В. С., Рееснер П., Пасторкова А., Фельдт Е. Г. Анализ частоты нормохромных эритроцитов с микроядрами в периферической крови мышей как метод выявления мутагенов // Бюлл. эксперм. биол. и мед. — 1997. — 33,8. — с. 1082–1087.
7. Schmid W. The micronucleus test // Mutat. Res. — 1975. — 31. — P. 9–15.
8. Коробейникова Э. Н. Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лабораторное дело. — 1989. — № 7. — с. 8 –10.
9. Placer Z. A. Lipid per oxidation system in biologist material. Bestimmung der lipoperoxidation in sonertierorganismus // Hahrung. — 1968. — 12,6. — P. 679–684.
10. Гаврилова В. В., Мишкорудная М. И. Спектрофотомерическое определение содержания гидроперекисейлипидов в плазме крови // Лабораторное дело. — 1983. — № 3. — с. 33–36.
11. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. — 1988. — № 1. — с.16–19.
12. Веревкина И. В., Точилкин А. И., Попова Н. А. Колориметрический метод определения SH–групп и S–S–связей в белках при помощи 5,5–дитиобис (2–нитробензойной) кислоты // Современные методы в биохимии. Под.ред. В. Н. Ореховича. М.: «Медицина», 1977. — с. 223–228.
13. Габриэлян Н. И., Липатова В. И. Опыт использования показателей средних молекул для диагностики при нефрологических заболеваний у детей // Лабораторное дело. — 1984. — № 3, — с. 13–15.
14. Шлейкин А. Г. Биохимические маркеры дыхательного дистресса / Экологическая безопасность городов // Материалы научной конференции Санкт — Петербурга, 5–6 октябрь 1993. — СПб., 1993. — с. 232–233.
15. Lowry O. H., Rosebough N. J. Farr A. L., Randal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 193. — P 265–275.
16. Изтлеуов М. К. Патогенез нарушений гомеостаза, вызванных избыточным поступлением хрома в организм, и пути их коррекции: автореф. …. докт.мед.наук: 14.00.16. — Москва, 2004. — 48с.
17. Goulart M., Batoreu M. C., Rodrigues A. S., Laires A., Rueff J. Lipoperoxidation products and thiol antioxidants in chromium exposed workers // Mutagenisis. — 2005. — 20: 311–315.
18. Wise S. S., Holmes A. L., Wise J. P. SH. Hexavalent chromium — induced DNA damage and repair mechanisms // Rev. Environ. Health. — 2008. — 23 (1): 39–57.
19. Изтлеуов М. К., Джаркенов Т. А., Мамырбаев А. А., Баспакова А. М., Изтлеуов Е. М., Абилов Т. С. Хром мен бор қосылыстарының бірлескен әсерінен ағзаның соматикалық жасаушаларында индукцияланған мутагенез және оны түзету // Медицинский журнал Западного Казахстана. — 2015. — 2(46). — с. 65–68.
20. Гулик Е. С., Костеша Н. Я., Борило Г. А. Влияние хитабиса и его компонентов на структурно-функциональное состояние тонкого кишечника и кроветворения облученных крыс // Вестник Томского государственного университета. Биология. — 2012. — № 3 (19) — с. 146–159.