Пренатальные эффекты бихромата калия и их коррекция у потомства крыс



Экопатогенный риск в Западном Казахстане связан с геохимическими особенностями — хромо-борный биогеохимический регион, нефтегазоперерабатывающий комплекс на фоне йододефицита [1, c.10–12; 2, c.11]. Первой в СНГ и второе в мире богатейшее месторождение хромитовых руд находится на территории Актюбинской области, где сосредоточены крупный обогатительный комбинат, заводы хромовых соединений и хромистых ферросплавов.

Вредное воздействие экотоксикантов (Cr⁺⁶, B, Ni и др.) хромо — борного биогеохимического региона может проявляться в возникновении бесплодия, самопроизвольных абортов и выкидышей, осложнениями беременности и родов, увеличением частоты врожденных пороков развития, рождением маловесного ребенка и угрозой внутриутробной асфиксии плода [3, с.128–136; 4, с.165; 5, с.45–46]. Это диктует необходимоcть фармакологической коррекции негативного влияния соединений хрома (Cr⁺⁶) на протекание и исходы беременности [6, c.141].

Целью данной работы являлось исследование эмбрионального, постнатального развития и состояния перекисного гомеостаза в печени и мозге плодов крыс, подвергнутых воздействию шестивалентного хрома (бихромата калия) во время беременности, и оценка влияние масляного экстракта корня лопуха и липоевой кислоты на проявления наблюдаемых отклонений (нарушений).

Методика. Работа выполнена на самках беспородных белых крыс массой 180–220г., полученных из вивария Центральной научно-исследовательской лаборатории Западно-Казахстанского государственного медицинского университета имени Марата Оспанова (г. Актобе, Республика Казахстана), которые содержались при естественной освещенности и максимальной стандартизации температурного и пищевого режимов сосвободном доступом к еде и воде. Все манипуляции были проведены в соответствие с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986). Протокол эксперимента был разработан при участии и одобрении этической комиссии вуза.

Самок и самцов ссаживали попарно в отдельных клетках. Первымднем беременности считали день обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках.

Первая группа оплодотворенных самок — контрольная. Вторая и третья группы самок получали бихромат калия ежедневно внутрибрюшинно в дозах перерасчета на чистый хром(Cr⁺⁶) — 25 мкг/кг массы тела, с 1-го по 19-й день беременности. Животным второй, третьей группы в течение периода беременности на фоне Cr⁺⁶дополнительно ежедневно внутрижелудочно вводили соответственно подсолнечное масло (группа «модель») и масляный экстракт корня лопуха — фитопрепарата — «Лопуха корня масло» (РК–ЛК — 5 № 014181) в дозах 2 мл/кг массы тела, а третьей — еще внутримышечно липоевую кислоту в суточной дозе 10 мг/кг массы тела.

Самки контрольной группы в течение беременности получали эквивалентный объем физиологического раствора внутрибрюшинно/внутримышечно и перорально подсолнечное масло.

Часть животных выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков на 20-й день беременности. Вскрывали брюшинную полость, вырезали матку, переносили в чашку Петри с физиологическим раствором. Подсчитывали количество резорбции, погибших и живых плодов, мест имплантации. В яичниках подсчитывали количество желтых тел беременности. На основании этих данных определяли доимплантационную, постимплантационную гибель, общую эмбриональную смертность и индекс плодовитости.

Другую часть самок оставляли до естественных родов и наблюдали за развитием потомства в течение месяца, регистрируя поведение, динамику массы тела и гибель (индекс выживаемости), и у месячных крысят исследовали состояние перекисного гомеостаза в тканях мозга и печени.

В комплекс исследования, позволяющего судить об интенсивности липопероксидации и мощности антиоксидантной защиты (АОЗ) в тканях входило определение уровня малоновогодиальдегида (МДА) [7, c.8–10], активности каталазы (КАТ) [8, c.17–19], супероксиддисмутазы (СОД) [9, c.11–12], содержания сульфгидрильных групп (SH-групп) с применением реактива Эльмана [10, c.227], вычисление соотношения SH/МДА — интегрального показателя сбалансированности перекисного гомеостаза [11, с.232–233], а также регистрация уровня молекул средней массы (МСМ) по методу [12, c.13–15]. Количество общих липидов определяли с помощью набора реактивов «Лахема», белка — по методу Lowry [13, c.265].

Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Существенность средних величин оценивали по критерию Стьюдента. Полученные результаты считали достоверными при ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение. Динамическое наблюдение за беременными крысами показывает, что подопытные самки, получавшие хром в дозе 25 мкг/кг массы тела, прибавляли в массе к концу беременности на 35 % меньше контрольных. Введение бихромата калия в исследуемой дозе беременным самкам достоверно не влияло на число желтых тел в яичниках (11,8 ± 0,76,  ≥ 0,05).Однако, индекс плодовитости уменьшался на 35 %.

Изучение эмбрионального материала показало, что Cr⁺⁶проявляет эмбриолетальное действия: доимплантационная эмбриональная гибель (ДИГ) увеличивается в 1,73 раза; постимплантационная (ПИГ) — в 2,8 раза; общая эмбриональная смертность (ОЭС) — в 1, 86 раза по сравнению с данными животных контрольной группы.

Совместное введение фитопрепарата «Лопуха корня масло» и липоевой кислоты уменьшало патологический эффект Cr⁺⁶ на процессы имплантации — резорбции плодов и эмбриональной смертности: ДИГ — снижается на 43 %; ПИГ — на 59 %, ОЭС — до 29,8±2,85 % ( ˃ 0,05). Количество живых плодов равняется 10,1±0,68 (в контроле — 9,7 ± 0,97), индекс плодовитости — 71,5±1,9 % (р˃0,05).

Таким образом, анализ полученных данных показывает, что негативное влияние бихромата калия (Cr⁺⁶) на беременных крыс проявляется в снижении прироста массы тела, индекса плодовитости, в увеличении до^- и постимплантационной гибели плодов. Фитопрепарат «Лопуха корня масло» (в дозе 2,5 мл/кг) при совместном введении с липоевой кислотой (в дозе 10 мг/кг) в значительной степени нивелирует патологический эффект шестивалентного хрома (25 мкг/кг) на эмбриональное развитие плодов.

Таблица 1

Влияние масляного экстракта корня лопуха илипоевой кислоты на некоторые функциональные параметры крысят, матери которых получали шестивалентный хром с 1 по 19 день беременности

Показатели	Контроль	Cr+6«модель»	Cr+6 +(ЛК + МЛ)
Вес при рождении, г. Масса крысят; г.:	5,17 ± 0,03	4,31 ± 0,07х	5,27 ± 0,150
на 7 день	11,3 ±0,21	8,87 ± 0,37х	11,3 ± 0,210
на 14 день	18,5 ± 0,20	14,0 ± 0,34х	17,8 ± 0,190
на 21 день	29,5 ± 0,43	23,1 ± 0,53х	28,5 ± 0,720
на 30 день	37,8 ± 0,58	28,0 ± 0,67х	37,0 ± 0,530
Индекс выживаемости, %	96,3 ± 3,7	74 ± 8,4х	83 ± 7,63
Постнатальная гибель, %	3,7 ± 3,6	26 ± 8,4 х	17,0 ± 8,7

Примечание * —  ˂ 0,05 по сравнению с контролям;

⁰ – ˂ 0,001 по сравнению с данными группы «модель».

Мониторинг за динамикой массы тела показывает, что при рождении вес крысят, матери которых получали шестивалентный хром в течение беременности, снижен на 17 %, на 7 — й день постнатального развития на 22 %, на 14 — й день — на 24 %, на 21-й день — 22 % и на 30 — й день — на 26 % по сравнению с показателями потомства в группе контроль.

При сравнительном анализе динамики массы тела, выживаемости в течение месяца после рождения, матери которых в условиях избыточного поступления хрома (10 ПДК) получали комбинацию «Лопуха корня масло» и липоевой кислоты, установили (таблица 1), что и при рождении, и на 7, 14, 21 и 30 –й дни постнатального развития отклонений от контроля массы тела крысят не наблюдается. Индекс выживаемости равнялся 83 ± 7,67 % (в контроле — 96,3 ± 3,7 %), постнатальная гибель — 17,0 ± 8,67 % (в контроле 3,7 ± 3,6 %) и остается в 4,6 раза выше контрольной.

Изучение перекисного гомеостаза в тканях мозга месячных крысят, матери которых получали шестивалентный хром в период беременность, позволили выявить повышение количество МДА на 41 %, активности СОД на 21 % на фоне снижения активности КАТ на 21 %, концентрации тиоловых группы на 16 % и коэффициента SH/МДА на 40 %. Эти обнаруженные нарушения перекисного гомеостаза приводят к преобладанию количество продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) над количеством антиоксидантов.

Анализ полученных результатов корректирующей терапии из комбинации «Лопуха корня масло» и липоевой кислоты свидетельствует о снижении дисбаланса в системе ПОЛ — АОЗ за счет ингибирования липопероксидации и уменьшения продукции МСМ (таблица 2).

Таблица 2

Перекисный гомеостаз втканях мозга месячных крысят, матери которых подвергались воздействию хрома иполучали корригирующую терапию— «Лопуха корня масло» илипоевая кислота впериод беременности

Показатель	Контроль	Cr+6 «модель»	Cr+6 +(ЛК + МЛ)
МДА, нмоль/мг	3,25 ± 0,10	4,6 ± 0,240	2,9 ± 0,16х
Каталаза, ммоль/мг/мин	19,3 ± 0,85	15,3 ± 0,840	22,7 ± 1,4х
СОД, %	30 ± 1,56	36,4 ± 1,510	31 ± 1,96х
SH, мкмоль/мг/мин	41,8 ± 1,68	35,2 ± 1,990	44,9 ± 0,97х
МСМ, усл.ед.	0,25 ± 0,017	0,29 ± 0,0150	0,20 ± 0,01х
SH/МДА	12,8 ± 0,61	7,7 ± 0,270	15,8 ± 0,76х

Примечание: ⁰ – ˂ 0,05 по сравнению с данными контрольной группы

*- ˂ 0,05 в сравнении с данными группы «модель»

Так, совместное введении «Лопуха корня масло» и липоевой кислоты приводило к уменьшению содержание МДА на 37 %, продукции МСМ — на 31 % и изменению АОЗ, о чем свидетельствует повышение активности КАТ на 48 %, уровня тиоловых групп (SH — групп) на 27 %. Активность СОД снижалась на 15 % (˂0,05) по сравнению с данными животных в группе «модель», что при возрастании активности КАТ приводит к уменьшению пероксида водорода и гидроксильных радикалов. Об этом свидетельствует и увеличение интегрального показатели сбалансированности перекисного гомеостаза — SH/МДА на 23 % (˂0,01); продукция МСМ — индекса эндогенной интоксикации уменьшается на 20 % (˂0,05) по сравнению с данными крысят контрольной группы.

Использование фитопрепарата и липоевой кислоты вызывает определенные изменения и в функционально — биохимическом статусе печени потомства, матери которых на фоне воздействия бихроматом калия получали данную комбинацию. Комбинация «Лопуха корня масло» и липоевой кислоты снижает содержание конечного продукта ПОЛ — МДА до нормы (1,4 ± 0,11 нмоль/мг), что свидетельствует об ингибировании свободнорадикального окисления (СРО) в печени месячных крысят. При этом активность СОД имеет тенденцию к снижению (40,2 ± 1,49 %, ˃0,05), КАТ к повышению на 13 % (≥0,05) на фоне достоверного увеличения уровня сульфгидрильных групп 19 % (<0,05), что приводит к возрастанию интегрального показателя сбалансированности перекисного гомеостаза на 15 % (˃0,05) по сравнению с данными животных контрольной группы. Продукция МСМ недостоверно уменьшена на 10 % в сравнении с контролем. Однако, комбинация редуцировала содержание МСМ на 32 % в сравнению с показателями крысят группы «модель».

Следовательно, у 30-дневных крысят, матери которых подвергались в период беременности воздействию шестивалентного хрома, наблюдается дисбаланс в системе ПОЛ — АОЗ, что отражает недостаточность в системе «тушения» свободнорадикальных цепных реакций и в целом — о снижении физиологических резервов организма. Как показали, результаты наших исследований применение комбинации масляного экстракта корня лопуха и липоевой кислоты ингибируют СРО за счет изменения в систем АОЗ (особенно неферментативного звена) и снижения продукции МСМ, что свидетельствует об их антиоксидантном, мембранопротекторном действии и позволяет рекомендовать для профилактики последствия хромового микроэлементоза, в том числе нарушений репродуктивной функции у населения биогеохимической провинции, так и у работников хромдобывающих и хромоперерабатывающих производств.

Таким образом, результаты исследования показывают, что использование комбинации «Лопуха корня масло» и липоевой кислоты приводит к снижению эмбриональной смертности, увеличению количество живых плодов (индекса плодовитость) и предупреждают задержку постнатального развития крысят, матери которых в период беременности получали шестивалентной хром, что выражается в нивелировании отставания в массе тела, в увеличении индекса выживаемости и в ингибировании свободнорадикальных процессов в тканях мозга и печени на фоне активизации системы АОЗ, особенно его неферментативного звена.

Литература:

1. Изтлеуов М. К., Изтлеуов Е. М. Экология и здоровье // Медицинский журнал Западного Казахстана. — 2006. — 2 (10). — с. 8–16.
2. Бекмухамбетов Е. Ж., Изтлеуов М. К., Джаркенов Т. А., Тусупкалиев Б. Экологическая система и здоровье населения Западного Казахстана // «Экология. Радиация. Денсаулық» IX-шы Халықаралық ғылыми-тәжірибелік конференция. Тамыз 29, 2013. — Семей, 2013. — с. 11.
3. Изтлеуов М. К. Окислительный метаболизм у беременных — работниц хромового производства и его коррекция // Вестник РУДН. — Серия «Медицина». — 2003. — № 1. — с. 128–138.
4. Тусупкалиев Б., Тусупкалиева Қ.Ш., Джунусова Н. Н. Хром бойынша биогеохимиялық аймақта тұратын аналардан туылған нәрестелердің бейімделу жағдайы // «Экология. Радиация. Десаулық». VII-ші Халықаралық ғылыми-тәжірибелік конференция. Тамыз 27, 2011. — Семей, 2011. — с. 165.
5. Жумабаева А. Н., Укыбасова Т. М. Морфофункциональные аспекты системы «мать — плацента — плод» при воздействии соединений хрома. — Актобе, 2001. — 132 с.
6. Изтлеуов М. К., Изтлеуов Е. М. Коррекция нарушений генеративной функции при хром — индуцированноммикроэлементозе // Астана Медициналық Журналы. — 2006. — № 3. — с. 141–144.
7. Коробейникова Э. Н. Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб.дело.- 1989. — № 7. — с 8–10.
8. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. — 1988. — № 1. — с. 16–19.
9. Чевари С., Андял Т., Штренгер Я. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте // Лабораторное дело. — 1991. -№ 10. — с.9–13.
10. Веревкина И. В., Точилкин А. И., Попова Н. А. Колориметрический метод определения SH — групп и S-S- связей в белках при помощи 5,5 — дитиобис (2 — нитробензойной) кислоты // Современны методы в биохимии. Под.ред. академика АМН СССР В. Н. Ореховича. — Москва «Медицина», 1977. — с. 223–228.
11. Шлейкин А. Г. Биохимические маркеры дыхательного дистресса / Экологическая безопасность городов // Материалы научной конференции Санкт-Петербурга, 5–6 октябрь 1993. — СПб, 1993. — с. 232–233.
12. Габриэлян Н. И., Липатова В. И. Опыт использования показателей средних молекул для диагностики при нефрологических заболеваний у детей // Лабораторное дело. — 1984. — № 3. — с. 13–15.
13. Lowry O. H., Rosebough N. J., Farr A. L., Randal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 193. — P. 265–275.