Исследование резистентности бактерий класса Staphylococcus к антибиотикам широкого спектра.



Целью работы является продемонстрировать, что бактерии класса стафилококков не поддаются воздействию антибиотиков.

Задачи работы.

1. Определить необходимость антибиотиков.

2. Проанализировать пользу антибиотиков для человека.

3. Проанализировать эффективность использования антибиотиков.

4. Провести эксперимент, который доказывает, что стафилококк не поддаются воздействию антибиотиков.

Для исследования использовалось: наблюдения, фотографирование, сравнительный анализ, работа с источниками информации, проведение экспериментов и анкетирований. Были изучены свойства часто спрашиваемых антибиотиков в аптеках. А так же был проведен эксперимент, который доказывал, что стафилококки не поддаются воздействию антибиотиков широкого спектра пенициллинового ряда.

Анкетирование провизоров

Нужно было выяснить, какие антибиотики чаще всего спрашивают. И выяснилось, это с помощью анкетирования провизоров.Был проведен опрос 23 аптек. Провизорам были заданы следующие вопросы:

1) Часто ли покупатели просят продать антибиотики пенициллинового ряда без рецепта?

«да» — 18 аптек

«нет» — 3 аптеки

«отказ от ответа» — 2 аптеки

2) Можно ли купить антибиотики пенициллинового ряда без рецепта, и в каких случаях?

«да» — 5 аптек, но не пояснили в каких случаях это можно сделать

«нет» — 6 аптек без пояснений

«нет»* — 12 отметили, что вышел закон запрещающий продажу антибиотиков без рецепта

3) Какие антибиотики пенициллинового ряда чаще всего спрашивали покупатели?

Все аптеки ответили по-разному, поэтому записала только самые спрашиваемые, это амоксиклав и флемоксин.

Народное анкетирование

Был проведен опрос возле аптек города Новосибирска. Чтобы сгруппировать опрошенных людей между собой, воспользовалась теорией психосоциального развития Эрика Эриксона. Юность (18–19 лет), молодость (19–35 лет), взрослость (35–60 лет), старость (от 60 лет).

Всего было опрошено 73 человека. Из опроса стало ясно, что большинство жителей 18–19 лет употребляют антибиотики по назначению врача, 19–35 лет чаще всего самостоятельно назначают себе курс лечения антибиотиками т. к. эта группа людей постоянно спешит. У них нет времени болеть, поэтому они пьют антибиотики чаще всего. 60 и более лет жители пьют курс антибиотиков если им назначил врач.

Подготовка питательной среды для эксперимента

Для проведения опытов с бактериями необходимо подготовиться. Для начала, должны подготовить питательную среду. Именно получение нужных питательных сред и создание оптимальных условий, обеспечивающих рост микроорганизмов в искусственных условиях. Для успешной постановки эксперимента исследователю необходимо выделить чистую культуру и подобрать оптимальную питательную среду для бактерий.

Для приготовления питательной среды, взяла нарезанное мясо говядины предварительно очищенного от костей, жира, сухожилий, пропустила через мясорубку. 500 г полученного фарша заливаю 1 л водопроводной воды, оставляю при комнатной температуре на 12 часов. Затем отжимаю мясо через марлю, и полученный настой кипячу 30 мин, остывший бульон фильтрую через ватный фильтр, довожу бульон до кипения добавляю 2 % агар-агара и кипячу 5 минут, добавляю 0,5 % хлорида натрия. Никаких других солей добавлять не требуется, т. к. они в достаточном количестве уже есть в бульоне. Предварительно перед заливанием питательной среды в чашки, они проходят термическую обработку в духовом шкафу. Заливаю нашу питательную среду в чашки Петри на ¾. Полученный бульон необходимо автоклавировать. У меня нет автоклава, поэтому, я использовала духовой шкаф при 210 градусов.

Рис. 1. Автоклавирование

Рис. 2. Отжимание мяса через марлю

Рис. 3. Фильтрация через ватный фильтр

Рис. 4. Варка питательной среды

Рис. 5. Повторное автоклавирование

Рис. 6. Готовые чашки Петри с питательной средой

Подсадка бактерий вчашки Петри

Один из самых распространенных методов проведения подсадки — это прикосновение пальцев рук к поверхности питательной среды до или после мытья. Было принято решение выращивать колонии с двух образцов:

— с пальцев рук, предварительно санитарно не обработанных(ввиду большего количества бактерий).

—с человеческой слюны, ввиду того, что там находится порядка трех сотен разных видов бактерий.

Рис. 7. Подсадка бактерий с рук

Рис. 8. Подсадка бактерий со слюны

Определение культур бактерий

Культуральные признаки бактерий характеризуются особенностью роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. На плотных питательных средах изучаются признаки изолированно от других выросших в чашке Петри колоний бактерий. В зависимости от их положения в среде различают поверхностные и глубинные колонии. Наиболее типично видовые признаки выражены у поверхностных колоний.

а) форма колоний — округлая, неправильная, амебовидная, ризоидная, мицелиальная.

б) размер колонии — точечные (диаметр 1мм), мелкие (диаметр 1–2мм), средние (диаметр 3–4мм), крупные (диаметр более 4мм).

в) край колонии — ровный, волнистый, лопастной, бахромчатый.

г) структура колонии — однородная, мелкозернистая, крупнозернистая, струйчатая, волнистая.

д) профиль колонии — плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный.

е) консистенция колонии — мягкая, слизистая, тягучая, хрупкая.

При этом форму, профиль, цвет, блеск определяют невооруженным глазом; край и структуру — при малом увеличении микроскопа; консистенцию — прикосновением к ее поверхности петлей; размеры — обычной линейкой.

Рис.9. Форма, профиль, край, структура колоний бактерийформа: а — округлая, б — неправильная, в — амебовидная, г — ризоидная, д — мицелиальная. Профиль: а — плоский, б — выпуклый, в — кратерообразный, г — бахромчатый. Край: а — ровный, б — волнистый, в — лопастной, г — бахромчатый. Структура: а — однородная, б — мелкозернистая, в — крупнозернистая, г — струйчатая, д — волнистая.

По данному алгоритму я определила, что в моих чашках Петри находится золотистый стафилококк, метициллинрезистентный золотистый стафилококк, плесень, стрептококки.

Выделение чистой культуры

Для выделения чистой культуры с чашки Петри нам понадобится: чашки Петри с чистой питательной средой для бактерий, три пробирки, самодельная микробиологическая петля из проволоки, дистиллированной вода, газовая горелка, пипетка или ватная палочка, маска и перчатки для защиты дыхательных путей и кожи рук от бактерий.

Берем микробиологическую петлю, нагреваем ее на газовой горелке до покраснения для дезинфекции, в момент, когда она остывает, ломаем колбу с дистиллированной водой, выливаем ее в пробирку примерно 2–3 мл, взяв микробиологическую петлю, соскабливаем колонию бактерий и помещаем ее в пробирку, тщательно перемешиваем до однородного раствора. Полученный однородный раствор собираем пипеткой и капаем в чашку Петри. Повторяем данный алгоритм до тех пор, пока не пересадим нужные колонии в новые чашки Петри.

Рис. 10. Дезинфекция микробиологической петли

Рис. 11. Сбор колоний в чашку Петри

Рис. 12. Пересадка бактерий в чашку Петри

Рис. 13. Конечный результат

Проведение эксперимента сантибиотиками

Для проведения эксперимента с антибиотиками, была необходима информация, о количественном содержании антибиотика в одной таблетке. Затем провести расчеты, чтобы сделать растворы разной концентрации. Благодаря этому мы выясним, при какой концентрации антибиотика бактерии начинают погибать. Антибиотики начинают действовать в крови человека при 1,5–3мг/мл, я буду отталкиваться от этих данных.

Расчеты концентраций антибиотика флемоксин:

Необходимо было приготовить растворы с концентрацией в 10, 30 и 60 % содержания антибиотика, для этого использовали метод разбавления: исходный раствор был получен путем растворения таблетки в 100 мл воды, его концентрация составила 500мг/100мл=5мг/мл. От данного раствора была взята аликвота 1 мл, путем разбавления которой были получены растворы нужной концентрации из расчета: Раствор 1:

50мкг/100мл=0.5мкг/мл (разбавление от исходного раствора до 10 %)

Раствор 2:

50мкг/29мл=1.6мкг/мл (раствор 30 %)

Раствор 3:

50мкг/14мл=3.3мкг/мл (раствор 60 %)

Раствор 4:

50мкг/9 мл=3.3мкг/мл (самый сильный раствор 100 %)

Рис. 14. Стаканы с разной концентрацией антибиотика «флемоксин»

Расчеты концентраций антибиотика амоксиклав квиктаб

Необходимо приготовить растворы с концентрацией в 10, 30 и 60 % содержания антибиотика, для этого использовали метод разбавления: исходный раствор был получен путем растворения таблетки в 200 мл воды, его концентрация составила 1000мг/200мл=5мг/мл. От данного раствора была взята аликвота 1 мл, путем разбавления которой были получены растворы нужны концентраций из расчета:

1 таблетка-1000мг

1000мг/200=5 мг/мл (берем от данного раствора 1 мл, продолжаем расчеты)

Раствор 1:

50мкг/100мл=0.5мкг/мл (разбавление от исходного раствора до 10 %)

Раствор 2:

50мкг/29мл=1.6мкг/мл (раствор 30%)

Раствор 3:

50мкг/14мл=3.3мкг/мл (раствор 60%)

Раствор 4:

50мкг/9 мл=3.3мкг/мл (самый сильный раствор 100%)

Рис. 15. Стаканы с разной концентрацией антибиотика

Проведение основного эксперимента

После проделанных расчетов, основываясь на минимальной бактерицидной концентрации в крови (1,5–3мкг/мл). Я решила проводить основной эксперимент. Надеваем медицинские резиновые перчатки и маску, чтобы защитить себя от бактерий. Чтобы начать мой основной эксперимент, потребовалось взять чашки Петри, в которых уже находилась пересаженная колония бактерий. Далее разводим антибиотики, как написано в расчетах. Берем пипетки для всех концентраций разные, чтобы растворы не смешивались, и получился чистый эксперимент. Делим чашки Петри на ровные доли маркером по поверхности крышки чашки. Осторожно приоткрываем чашки Петри и капаем разными концентрациями на поверхность питательной среды. В середине у меня условный 100 % раствор, к краям концентрация растворов меняется, далее идет 60 %,30 %,10 %. Ведем наблюдение до того, как появится первый результат. Для выявления точности полученных данных опыт был проведен четыре раза.

Результаты опыта занесены в таблицы:

№	Наименование	Результат	Время эксперимента	Примечание
1	Чашка Петри с золотистым стафилококком 1	ничего не наблюдается	24 ч.	Никаких изменений не замечено
		ничего не наблюдается	48 ч.
		ничего не наблюдается	72 ч.
		ничего не наблюдается	96 ч.
2	Чашка Петри с золотистым стафилококком 2	ничего не наблюдается	24 ч.	Никаких изменений не замечено
		ничего не наблюдается	48 ч.
		ничего не наблюдается	72 ч.
		ничего не наблюдается	96 ч.
3	Чашка Петри с золотистым стафилококком 3	ничего не наблюдается	24 ч.	Никаких изменений не замечено
		ничего не наблюдается	48 ч.
		ничего не наблюдается	72 ч.
		ничего не наблюдается	96 ч.
4	Чашка Петри с золотистым стафилококком 4	ничего не наблюдается	24 ч.	Никаких изменений не замечено
		ничего не наблюдается	48 ч.
		ничего не наблюдается	72 ч.
		ничего не наблюдается	96 ч.

Рис. 16. До добавления антибиотиков

Рис. 17. После добавления антибиотиков

Результаты экспериментов. Выводы

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что стафилококк не поддаются воздействию антибиотиков пенициллинового ряда, а конкретно флемоксином и амоксиклавом. Занимаясь самолечением, люди усугубляют болезнь, параллельно нанося вред собственному организму. Из-за того, что они не могут разобраться в том, было ли заболевание вызвано вирусами или бактериями. Проще говоря, антибиотики теряют свою эффективность. Стафилококки, пневмококки, и даже палочка Коха, возбудитель туберкулёза, имеют резистентность к повсеместно применяемым антибиотикам широкого спектра, что и было доказано в моей работе. Что делает их почти неуязвимыми к лечению. От этого некоторые заболевания плохо поддаются лечению, развиваются тяжёлые септические состояния.

Рекомендации

Бактерии, обладающие резистентностью к антибиотикам, предшествуют медицинскому применению антибиотиков людьми; тем не менее, широкое применение антибиотиков сделало бактерии более резистентными в процессе давления эволюционного отбора.

Причины широкого применения антибиотиков включают: повышение глобальной доступности в течение долгого времени, начиная с 1950-х годов неконтролируемые продажи антибиотиков во многих странах с низким или средним уровнем дохода, где их можно получить без рецепта, что потенциально приводит к применению антибиотиков без предписания врача. Это может привести к возникновению резистентности у любых оставшихся бактерий.

Применение антибиотиков в животноводстве в качестве добавки в корм для скота в малых дозах для стимулирования роста является общепринятой практикой во многих промышленно развитых странах, и, как известно, приводит к повышению уровня резистентности. Выброс большого количества антибиотиков в окружающую среду во время фармацевтического производства за счет ненадлежащей очистки сточных вод повышает риск того, что устойчивые к антибиотикам штаммы будут развиваться и распространяться. Точно неизвестно, способствуют ли бактерицидные вещества в мыле и других продуктах развитию устойчивости к антибиотикам, но они не рекомендуются к применению по другим причинам

Поэтому, я хочу порекомендовать принимать антибиотики только по назначению дипломированного медицинского работника, но также не стесняйтесь спрашивать, действительно ли они вам необходимы. Если вы принимаете антибиотики, всегда заканчивайте полный курс, даже если вы почувствовали себя лучше, так как прекращение приема содействует росту лекарственно устойчивых бактерий

Литература:

1. Блейзер Мартин. Плохие бактерии, хорошие бактерии. — Нью-Йорк: Э, 2014. — 350 с.
2. Евгений Комаровский. Бактерии и бактериальные инфекции. Стафилококк. —: Книжный клуб 36.6, 2008. — 32 с.
3. Айдан Бен-Барак. Почему мы до сих пор живы? Путеводитель по иммунной системе. —: Лаборатория знаний, 2016. — 210 с.
4. Леонид Страчунский, С. Козлов. Антибиотики: клиническая фармакология. Руководство для врачей. —: Амипресс, 1994. — 208 с.
5. Хоулт Дж., Криг Н. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Том 1. —: Мир, 1997. — 208 с.
6. Кирилл Стасевич. Почему антибиотики бессильны против вирусов?. —: Журнал «Наука и жизнь» № 7, 2014. — 208 с.7.
7. Микробиология дома: выращиваем полезные бактерии // probakterii. URL: https://probakterii.ru/prokaryotes/raznoe/vyrashhivanie-bakterij.html (дата обращения: 28.04.2018).
8. Антибиотики — только по назначению врача! // my-health. URL: http://my-health.ru/content/252-antibiotiki-tolko-po-naznacheniyu-vracha (дата обращения: 28.04.2018).