Использование метода Лоури для количественного определения белка в альбумине

Введение. Альбумин – природный белок, составная часть фракции крови человека, в состав которого входят все 20 незаменимых аминокислот. Растворы альбумина являются эффективным средством коррекции гипоальбуминемии различного генеза, восстановления коллоидно – онкотического давления, нарушенной центральной и периферической гемодинамики, а также как средство дезинтоксикационной терапии при дегидратации и «сгущении» крови.

Для определения концентрации белка существующая нормативная документация рекомендует использовать метод, основанный на способности пептидной связи образовывать комплексы с солями меди в щелочной среде, который обеспечивает высокую чувствительность, однако линейность биуретовой реакции зависит от концентрации ионов Cu²⁺. При низком содержании ионов двухвалентной меди в среде значительная ошибка наблюдается при определении низких концентраций белка. При высоком содержании ионов Cu²⁺ необходимо увеличивать pH для их стабилизации, но при значительном увеличении pH проба мутнеет и становится непригодной для анализа уже через 30 мин. Изменение окраски раствора при использовании биуретового реактива пропорционально не столько концентрации белка как таковой, сколько количеству пептидных связей. Метод может давать завышенные результаты в присутствии олигопептидов, которые аналогично белкам реагируют с биуретом. В связи с чем, актуальным остается вопрос разработки альтернативного метода. Проблема определения концентрации белка насчитывает уже более 60 лет. Окончательно она не решена до сих пор. Очевидно, что создание "идеального метода" неосуществимо в силу уникальности структуры каждого белка.

Метод Лоури обладает высокой чувствительностью (10-60 мг/л), но интенсивность окраски пропорциональна не концентрации общего белка, а количеству тирозина и триптофана. Содержание этих аминокислот в различных белках различно. Так, в альбуминах и γ-глобулинах оно различается более чем на 20%. Поэтому метод Лоури широкого применения в медико-биологической практике не нашел, хотя при определении концентрации индивидуальных белков он – один из лучших.

Целью настоящего исследования является разработка способа количественного определения белка методом Лоури и валидационная оценка метода.

Объектом исследования был раствор альбумина 10%, производимый на Челябинской станции переливания крови [2]. В качестве стандартного образца использовали стандартный образец предприятия (СОП) альбумина с концентрацией 9,98%. Содержание белка в СОПе определяли по эталону методом Къельдаля. (Эталон стандартизирован и предоставлен Центральной лабораторией государственного контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов).

Определение проводили по методике ГФ XII издания без предварительного осаждения белка [3]. Было установлено, что продукт взаимодействия альбумина с реактивом Фолина характеризуется максимумами светопоглощения при 330±2, 345±2 и 750±2 нм (рис. 1).

Рис. 1

При построении калибровочных графиков использовали раствор стандартного образца. Для этого в мерную колбу вместимостью 25 мл вносили, соответственно, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 … 1 мл раствора СОП альбумина, прибавляли по 5 мл реактива Фолина, доводили водой до метки, выдерживали 30 минут и измеряли оптическую плотность полученных растворов в максимумах светопоглощения. Было установлено, что в интервале концентраций 0,04 – 0,2% наблюдается линейная зависимость в максимумах светопоглощения при 345±2 и 750±2 нм.

Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции, величина которого должна быть не ниже 0,99. Полученные данные полностью соответствуют данному критерию. Было установлено, что значения коэффициента корреляции наиболее достоверно при использовании в качестве аналитической длины волны 750 нм (R²= 0,9921). Расчет количественного содержания белка и валидационную оценку метода проводили по стандартному образцу [1]. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты количественного определения белка методом Лоури

Установлено, что метод отличается воспроизводимостью и небольшой погрешностью определения, что дает основание использовать его при количественной оценке белка в лекарственных формах.

Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания белка в растворах, полученных путем добавления определенного количества стандарта к исследуемому раствору. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Определение правильности методики

Среднее значение выхода для альбумина составило 99,43 %. Критерий приемлемости – средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100 %, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5 %.

Выводы.

1. Изучена возможность использования цветной реакции с реактивом Фолина для идентификации и количественной оценки белка в альбумине.

2. Определена линейность и подчиняемость закону Бугера – Ламберта – Бера.

3. На основании результатов количественного определения белка в различных сериях альбумина проведена статистическая обработка.

Литература:

1. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. – 2002, Т. 57, № 2. – С. 118-129.

2. Альбумин 10% раствор для инфузий ФСП ЛС – 001269 – 061011.

3. Государственная фармакопея Российской Федерации / Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. – 704 с.