Особенности приживления аутодермотрансплантатов при воздействии препарата «Винфар»

Введение

Приживление кожных лоскутов при проведении аутодермопластики в 20 – 40% сопровождается в последующем лизисом трансплантатов [1]. Одной из основных причин неудовлетворительных исходов является несостоятельность механизмов репаративного гистогенеза. Ключевую роль в пролиферации и дифференцировке различных клеток кожи и других тканей играет группа пептидов, относящихся к фактору роста фибробластов (ФРФ) [5]. В настоящее время проводятся экспериментальные исследования для определения возможностей применения ФРФ в медицине [3, 4, 6]. В 2009 году в эксперименте сотрудниками кафедры травматологии и ортопедии ОрГМА под руководством профессора В.И. Никитенко были получены продукты жизнедеятельности бактерий штамма Bacillus subtilis 804, стимулирующие рост фибробластов человека в культуре. После проведенных экспертиз в институте им. Склифосовского было подтверждено наличие в данных метаболитах ФРФ (Патент № 2427644 от 27.08.2011). На основе данных метаболитов в 2011 году В.И. Никитенко разработан и зарегистрирован препарат «Винфар» (Свидетельство на товарный знак № 433087 от 23.03.2011), выпускаемый в настоящее время ООО «Бакорен». Таким образом, несомненный интерес представляет изучение структурно-функциональных аспектов биостимулирующего влияния препарата «Винфар» на процессы репаративной регенерации, что до сих пор не проводилось.

Цель работы – изучение влияния препарата «Винфар» на процессы заживления глубоких ожоговых ран кожи при проведении аутодермопластики.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования проводили на 40 крысах-самцах линии «Вистар» массой 180,0 ± 10,0 г. Была использована модель ожоговой раны кожи (термический ожог III Б степени). Сорока крысам под фторотановым наркозом на предварительно выбритые участки в межлопаточной области спины были нанесены глубокие контактные ожоги площадью 2 см² (аппликация на кожу в течение 35 c плоского дна стеклянной пробирки с водой нагретой до 100°C). После формирования струпа на 7-9 сутки была выполнена некрэктомия. После очищения ран и формирования грануляционной ткани на 14-15 сутки эксперимента выполнялась аутодермопластика. Аутодермотрансплантат (АДТ) забирали с выбритого участка спины марочным способом. Животные были разделены на 2 группы по 20 крыс: 1 – опытная, крысам которой зону раневого дефекта кожи непосредственно перед укладкой АДТ орошали 1,0 мл препарата «Винфар»; 2 – контрольная, в которой на рану наносили 1,0 мл физиологического раствора. Животных выводили из опыта на 3, 7, 11 и 21 сутки после нанесения ожоговой раны кожи. Забой и взятие материала осуществлялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13.11.1984 г. № 724). У опытных и контрольных животных иссекали участки кожи с послеоперационными ранами и подлежащими тканями. Кусочки тканей фиксировали в 10% растворе формалина, забуференного по Лилли, затем обезвоживали в этаноле возрастающей крепости и заливали в целлоидин-парафин по общепринятой методике. Гистосрезы толщиной 5-6 мкм после депарафинизации исследовали при помощи световой микроскопии с применением гистологического (окраска гематоксилином Майера и эозином), гистохимического (окраска по Маллори, по Ван-Гизону, толуидиновым синим), иммуногистохимического (выявление экспрессии белка Ki-67, коллагена I – IV типа) методов исследования и морфометрии. В ходе иммуногистохимического исследования использовали моноклональные антитела и систему визуализации фирмы BioGenex, США.

Результаты и обсуждение

При гистологическом исследовании обнаружено, что из десяти контрольных животных только у четырех после фиксации и проводки материала АДТ были тесно связаны с подлежащей тканью. В условиях опыта все пересаженные кусочки оказались прочно фиксированы к месту пересадки.

На 11 сутки после пересадки кожи в толще АДТ контрольной группы животных сохраняется слабовыраженная, но диффузная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация с примесью эозинофилов, проникающая из подлежащего раневого ложа. В краевых участках АДТ митотическая активность клеток базального и шиповатого слоев выросла до 45,8±0,5 ‰ по сравнению с участками, удаленными от этой зоны (18,3±0,4‰), что подтверждается иммуногистохимическим исследованием на выявление экспрессии белка Ki-67 в пролиферирующих клетках.

В почти редуцированной грануляционной ткани под АДТ, иногда встречаются очаги расширенных полнокровных сосудов, питающих пересаженный участок кожи. В результате эпителизации с краёв АДТ образуется немногослойный эпидермис, который рыхло связан с подлежащей тканью, а многослойное строение с признаками ороговения отмечается только в проксимальных отделах. Под эпидермисом располагается незрелая неоформленная рыхлая соединительная ткань с большим количеством фибробластов, внеклеточного матрикса, полнокровными и ещё многочисленными сосудами, и сохраняющейся лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией. В соединительной ткани продолжается фибриллогенез – образуются тонкие волокона незрелого коллагена III типа, беспорядочно расположенные в толще фибриллярного матрикса.

В толще АДТ опытной группы на 11 сутки после пересадки сохраняется лишь очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация только в краевых отделах на границе с участками реэпителизации. В остальном строение АДТ напоминает строение интактной кожи краёв раны.

Краевая эпителизация на 11 сутки после аутодермопластики завершена, многослойный эпидермис приобретает все функциональные слои (5-6 слоёв) и признаки поверхностной кератинизации. Что соответствует общепризнанным представлениям о нормальном строении эпидермиса кожи крыс [2]. Подлежащая соединительная ткань с небольшим количеством сосудов, волокнистый матрикс преобладает над аморфным, волокна расположены с заметным выравниванием параллельно фибробластам и базальной мембране эпидермиса, что определяется функциональной нагрузкой на вновь образованную ткань. Выражен синтез зрелого коллагена I типа, почти отсутствующий у животных контрольной группы на этом же сроке эксперимента. Сохраняется незначительный диффузный лимфо-гистиоцитарный инфильтрат. Среди многочисленных фибробластов начинают появляться единичные фиброциты. В связи с завершением формирования эпителиального пласта, дифференцирующегося на все функциональные слои, показатель митотической активности краевых участков АДТ снижается по сравнению с контролем до 32,3±0,4‰, и остается одинаковым по всей площади пересаженного участка кожи.

В прижившихся АДТ контрольной группы на 21 сутки после пересадки сохраняется слабая, но диффузная лимфо-гистиоцитарная воспалительная инфильтрация со склеротическими изменениями в дерме. В подлежащей к АДТ ткани грануляции редуцированы, но сохраняется лимфогистиоцитарная реакция с многочисленными сидерофагами, которые, вероятно, подтверждают замедленную редукцию сосудов грануляционной ткани ложа АДТ с длительным эритродиапедезом и экстракапиллярным лизисом эритроцитов. Краевая эпителизация выражена слабо, эпителий с подлежащей тканью связан рыхло, легко травмируется и отслаивается, в связи с чем, местами появляются открытые участки грануляций с выраженной воспалительной инфильтрацией и склерозом. Задержка эпителизации ведет к преждевременному склерозированию грануляционной ткани, что, в свою очередь, замедляет эпителизацию таких участков. Под пластом вновь образованного эпителия зрелая грануляционная ткань с признаками редукции сосудов, фибриллогенеза и выраженной воспалительной реакции, что подтверждает асинхронность течения стадий репаративного процесса.

В опыте на 21 сутки после пересадки АДТ по строению и гистоархитектонике идентичен интактной коже данной области и плотно фиксирован с подлежащим ложем, которое представлено так же органотипичной гиподермой с пролиферирующими дериватами. Воспалительная инфильтрация отсутствует, грануляционная ткань полностью редуцирована. Встречная краевая эпителизация с АДТ и с кожи краёв раны завершена, вновь образованный эпидермис, многослойный с признаками ороговения, покрывает плотную неоформленную соединительную ткань, ход волокон, которой чаще параллелен базальной мембране эпидермиса.

Таким образом, морфологическая картина изменений АДТ и репаративного процесса в окружающих его тканях, как на 11 сутки в опытной группе, визуализируется и в условиях контроля, но только на 21 сутки эксперимента. При этом в контроле всё ещё сохраняется диффузный лимфогистиоцитарный инфильтрат, замедлено течение краевой реэпителизации с АДТ, а так же выражен склеротический процесс, как в АДТ, так и в окружающих его тканях. В результате этого на 21 сутки у животных контрольной группы, не смотря на успешное приживление АДТ, не достигнута органотипичность пересаженного участка кожи. Из-за асинхронного течения стадий репарации в окружающих АДТ тканях, процесс восстановления идёт по типу субституции с формированием грубой рубцовой ткани. Несомненна роль тесного взаимодействия процессов эпителизации и роста грануляционной ткани: эпителий обладает способностью стимулировать рост соединительной ткани, а также вырабатывает коллагеназу, участвующую в перестройке рубца. Задержка же эпителизации в контрольной группе ведет к преждевременному склерозированию грануляционной ткани, что, в свою очередь, замедляет эпителизацию таких участков.

Выводы

Данные гистологического исследования доказывают, что у животных, получавших «Винфар», происходит ускоренное восстановление функций клеток-эффекторов репаративного процесса, что обеспечивает благоприятные условия микроокружения для более эффективного и неосложнённого приживления АДТ.

Литература:

1. Шапкин Ю.Г. Способ повышения эффективности пластического закрытия ран после отморожения // Анналы хирургии. – 2010. – №5. – C.72-74.

2. Шаповалов Д.А., Голуб А.П. Особенности строения кожи крыс в норме и при действии пирогенала // Морфологія. – 2008. – Т. ІІ. – №2. – С.71-74.

3. Akita S., Akino K., Imaizumi T. Basic fibroblast growth factor accelerates and improves second-degree burn wound healing // Wound Repair Regen. – 2008. – Vol. 16. – № 5. – P. 635-641.

4. Bendfeldt K., Radojevic V., Kapfhammer J. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier // J. Neurosci. – 2007. – Vol. 27. – № 12. – P. 3260-3267.

5. Böttcher R.T., Niehrs C. Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development // Endocr. Rev. – Vol. 26. – № 1. – P. 63–77.

6. Yao C., Yao P., Wu H., Zha Z. Acceleration of wound healing in traumatic ulcers by absorbable collagen sponge containing recombinant basic fibroblast growth factor // Biomed. Mater. – 2006. – Vol. 1. – № 1. – P. 33-37.