Определение флавоноидов в траве Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei) методом ВЭЖХ

Трава Володушки золотистой(Herba Bupleuri aurei) обладает выраженным желчегонным, гепатопротекторным и антиоксидантным эффектами и может быть использована при патологии гепатобилиарной системы. Согласно литературным данным комплекс БАВ травы Володушки золотистой, оказывающий терапевтический эффект содержит флавоноидные соединения.

Целью работы является идентификация и количественное определение содержания флавоноидов в траве Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei).

Объектом исследования служила трава Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei). Образцы сырья собраны на территории Алтайского края, близ Барнаула, Бийска, Горно-Алтайска, а также близ Уфы и Новосибирска. Сырье заготовлено в период начала цветения (июнь) в фазе максимального накопления действующих веществ.

Экспериментальная часть. Изучение содержание флавоноидов в сырье проводили методом обращеннофазной ВЭЖХ с фотометрическим детектированием на приборе Аligent 1100. Были использованы следующие стандарты: Кверцетин (ICC Inc, USA Indofine); CAS: 117–39–5.; Кемпферол (ICC (Indofinе Chemical Company), Inc, USA); CAS: 520–18–3; Изорамнетин (ICC Inc, USA Indofine); CAS: 480–19–3; Лютеолин (ICC Inc, USA Indofine) CAS: 491–70–3, Гиперозид (кверцетин 3-О-галактозид) CAS 482–36–0–83388F (Sigma-Aldrich Chemie GmbH), Рутин CAS 207671–50–9 — R5143 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH), Астрагалин CAS 480–10–4 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH).

Определение флавоноидов — агликонов.

Приготовление стандартного образца. Для приготовления стандартного образца с концентрацией 0,05 мг/см³ 5 мг стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем до метки метанолом.

Подготовка пробы для анализа. Навеску измельченной травы 1,0 г помещали в круглодонную колбу, добавляют 100 см³ 70 % этанола и 2 мл соляной кислоты и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа 30 мин. Раствор количественно переносили в мерную колбу на 100 см³ и доводят до метки 70 % этанолом. Затем колбу помещали на 5 минут в ультразвуковую баню. Затем пробу для ВЭЖХ анализа фильтровали через мембранный фильтр и использовали для проведения анализа.

Условия хроматографического анализа:

Колонка: октадецилсиликагель 5мкм, 250×4,6 (например, Phenomenex Luna 5мкм C18(2));

Подвижная фаза: ацетонитрил — раствор трифторуксусной кислоты рН 2,6 (40:60); Скорость подвижной фазы: 1,0 см³/мин;

Температура колонки: 30^ОС;

Детектирование: УФ, λ= 365 нм.

Объем вводимой пробы: 10 мм³

Расчет содержания индикаторных компонентов осуществляют по градуировочному графику или по формуле:

_{X =} C × S1 × V

S₂× m,

где: С — концентрация соответствующего стандартного раствора, мг/см³;

S₁ –площадь пика определяемого компонента в анализируемой пробе;

S₂ — площадь пика определяемого компонента в стандартном образце;

V — общий объем разведения образца, см³;

m — масса навески, г;

Рис. 1. Хроматограмма травы Володушки золотистой (Лютеолин, Кверцетин, Кемпферол, Изорамнетин)

В соответствии с результатами анализа содержание агликонов в образцах травы Володушки золотистой составило: Лютеолин — 0,1 мг/г, Кверцетин — 3,6 мг/г, Кемпферол — 0,3 мг/г, Изорамнетин — 2,1 мг/г.

Определение Гиперозида, Астрагалина и Рутина.

Подготовка стандартного образца. Для приготовления растворов стандартных образцов с концентрацией 0,1 мг/см³ точные навески 10,0±0,1мг гиперозида и 10,0±0,1мг рутина переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, до половины заполненные метанолом, перемешивают до полного растворения веществ, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Подготовка пробы для анализа. Навеску измельченной травы 1,0 г помещают в круглодонную колбу, добавляют 100 см³ 50 % этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Раствор количественно переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят до метки 50 % этанолом. Затем колбу помещают на 5 минут в ультразвуковую баню.

Условия хроматографического анализа:

Колонка: октадецилсиликагель 5мкм, 250×4,6 (например, Phenomenex Luna 5мкм C18(2));

Скорость подачи элюента: 1,0 см³/мин;

Детектирование: УФ, λ=360 нм;

Объем вводимой пробы: 10 мм³;

Подвижная фаза:      трихлоруксусная кислота, рН=2,5 – 70 %

ацетонитрил — 30 %

Рисунок 2. Хроматограмма травы Володушки золотистой (Рутин, Гиперозид, Астрагалин).

Расчет содержания индикаторных компонентов осуществляют по градуировочному графику или по формуле:

_{X =} C × S1 × V

S₂× m,

где: С — концентрация соответствующего стандартного раствора, мг/см³;

S₁ –площадь пика определяемого компонента в анализируемой пробе;

S₂ — площадь пика определяемого компонента в стандартном образце;

V — общий объем разведения образца, см³;

m — масса навески, г

В соответствии с результатами анализа содержание Рутина в образцах травы Володушки золотистой составил — 2,1 мг\г, Гиперозида — 1,6 мг\г, Астрагалина — 0,1 мг\г.

Выводы: Проведенное исследование показало наличие в траве Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei) Лютеолина — 0,1 мг/г, Кверцетина — 3,6 мг/г, Кемпферола — 0,3 мг/г, Изорамнетина — 2,1 мг/г, Рутина — 2,1 мг\г, Гиперозида — 1,6 мг\г, Астрагалина — 0,1 мг\г. Полученные результаты будут использованы в дальнейшем фитохимическом анализе сырья.

Литература:

1.                              Беликов В. В., Шрайбер М. С. Методы анализа флавоноидных соединений// Фармация, 1970. — № 1.

2.                              Головкин Б. Н. Биологически активные вещества растительного происхождения.-М.: Наука, 2001.

3.                              Гордиенко А. Д. Гепатопротекторный механизм действия флавоноидов// Фармация.-1990.-№ 3

4.                              Croft K. D. The chemistry and biological effects of flavonoids and phenolic acids// Annals New York Academy of Sciences. 1998, Vol.854