Эффективность применения метода микроклонального размножения древесно-кустарниковых растений



Краткий обзор по основным вопросам микроклонального размножения древесно-кустарниковых растений. Культивирование in vitro имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами вегетативного размножения, однако присутствуют и отрицательные характеристики. Этот метод позволяет получить большое количество клонов генетически идентичных древесно-кустарниковых растений и является наиболее приемлемым для озеленения городов и населенных пунктов.

Ключевые слова: микроклональное размножение, in vitro культура, фитогормоны, биореактор, древесно-кустарниковые растения.

На сегодняшний день на территории Западного Казахстана произрастает более 30 видов древесно-кустарниковых растений [1, с. 29]. Основная масса зеленых насаждений расположены в поймах рек (пойменные леса) и склонах лощин и балок (байрачные леса) [2, с. 36]. Около 8 % видов ( бересклет бородавчатый, боярышник сомнительный, дуб обыкновенный, лещина обыкновенная, ольха черная (клейкая), майкараган Волжский, катран татарский ) внесены в Красную книгу Казахстана (2006) и Зеленую книгу Западно-Казахстанской области [1, с. 30]. Для озеленения крупных городов значительную роль имеет быстрый рост древесно-кустарниковых насаждений, а культивирование in vitro позволяет добиться результата за короткий период [3, с. 175]. Данный обзор представляет исследования авторов, которые используют различные технологии как для микроклонального размножения древесных пород, так и для адаптации растений при пересадке в тепличные и полевые условия.

Для успешного применения метода микроклонального размножения особое значение имеет правильный подбор питательных сред. Для соматического эмбриогенеза гибридной осины (Populus tremula L. × Populus tremuloides Michx) были выбраны побеги взрослого растения и инкубированы на средах Hybrid Aspen, разработанных авторами, а именно HASP-4 и HASP-1 [4, с. 186]. В результате в культуре тканей получили соматические зародыши (высотой 2–2,5 см), от которых отделяли регенерированные побеги (2,5–4 см).

In vitro культура используется для быстрого размножения редкого и исчезающего вида Quercus lusitanica Lam. или карликового дуба (семейство Fagaceae). В исследованиях M. C. San Jose´ и др. применили среды GD (Gresshoff and Doy, 1972), Mc Cown Woody Plant Medium (WPM) и Мурасиге Скуга (МС) с добавлением 0,1 мг/л бензиладенина (БА), 30 г/л сахарозы и 6,5 г/л Vitroagar [5, с. 1579]. Сегменты ветвей находились в камере роста в течение 2–3 недель и затем сравнивались характеристики 2-х разных генотипов (CDL и SC1) по количеству развитых побегов. Количество развитых побегов было намного выше у генотипа CDL, чем в SC1, что привело к большему количеству исходных эксплантов (115 у CDL по сравнению с 43 у SC1).

Исследователи для in vitro размножения Salix viminalis отбирали побеги, полученные из активно растущих ветвей зрелого дерева, и после стерилизации погружали их в биореакторы RITA и plantform TM с применением систем временного погружения [6, с. 68]. Была протестирована питательная среда с добавлением 6БА 0,22 мкМ, а именно: МС половинной концентрации; ½ МС с добавлением 1,44 мкМ гибберелловой кислоты (GA3) и МС полной концентрации, все с добавлением 3 % сахарозы [6, с. 70]. В биореакторе plantform TM по истечению 6 недель инкубирования на среде ½ МС с добавлением БА и 3 % сахарозы было 100 % укоренение эксплантов.

Биореакторы также эффективно использовали другие ученые при микроклональном размножении проростков Quercus robur L. (дуба обыкновенного). Для тестирования двух систем культивирования (Microbox и Plantform) авторы использовали среду WPМ с разными концентрациями фитогормонов: 0,2–1 мг/л БА [7, с. 1130]. В результате ученые пришли к выводу, что на биоректорах Plantform со средой WPМ + БA 0,2 мг/л выход биомассы составил 87 %, тогда как в системе Microbox выход был 67 %.

Ahmad A. с соавторами для исследования влияния PGR (plant growth regulators) на индукцию в культуральной среде MС invitro проростков инокулировали эксплантами Pterocarpus marsupium Roxb или индийского сандала среду, содержащую различные дозы GA3 и тидиазурона (TDZ) (0,10–1,0 мкМ) [8, с. 458]. Было выявлено, что на 4 неделе GA3 в концентрации 0,50 мкМ индуцировано образование максимального количества на 1 проросток 2,90 побегов со средней длиной 3,95 см, а спустя 8 недель было зарегистрировано 3,82 побега на проросток со средней длиной 5,22 см. При этом для TDZ на 4 неделе эти значения достигли 14,18 на проросток со средней длиной побега 3,22 и 18,61 побегов со средней длиной 3,50 см через 8 недель.

Растение Pinus elliottii Engelm. var. (сосна косая) используется в озеленении городов с резко-континентальным климатом, а также в промышленности для производства древесины и смолы. Для культивирования использовались среды МС и Westvaco5 (WV5) с добавлением 10 и 25 мкМ бензиламинопурина (БАП) [3, с. 176]. В результате авторы установили, что среда МС с 10 мкМ БАП показала низкий процент индукции (70 %) по сравнению со средами МС + БАП 25 мкМ; WV5 + БАП 10 мкМ и WV5 + БАП 25 мкМ (90–94 %). Среда MС в целом привела к образованию 4–5 побегов/эксплант, что было немного ниже (p>0,05), чем 6–7 побегов/эксплант, обнаруженных на среде WV5 [3, с. 178].

Среди других факторов, влияющих на эффективность микроклонального размножения не менее важным является возраст материнского дерева. В качестве материала Arnis Gailis и др. использовали 15-летние деревья и 1-летние привои от 3-летних подвоев Betula pendula Roth. Установлено, что чем старше дерево, тем меньше процент инициации побегов березы (у однолетних побегов 66 %, у 15-летних деревьев 39 %) [9, с. 803]. Сезон сбора материала также влияет на количество инициированных побегов, так экспланты, собранные в марте и апреле показали более высокую долю инициации (64 % в марте и 67 % в апреле), чем экспланты, собранные в июне и сентябре (31 % и 29 % зародившихся побегов, соответственно).

M. Manokari и др. выявили, что растение Vitex negundo L. или прутняк китайский (семейство Lamiaceae) способно самовосстанавливаться в зависимости от условий культивирования. Ростки регенерировали из эксплантатов узловых побегов на среде MС с добавлением 1,5 мг/л 6-БАП, а после их размножали на среде 0,5 мг/л БАП и 0,25 мг/л индол-3-уксусной кислоты (ИУК) и укореняли на среде ½ MС, содержащей 1,0 мг/л ИУК [10, с. 631]. Исследование показало, что проростки, выращенные в условиях in vitro имели значительные структурные нарушения и были недоразвиты, однако при пересадке в тепличные, а затем полевые условия, прошел процесс их самовосстановления.

L. Agustini и др. рассматривали симбиоз амбускулярной микоризы (АМ), которая может влиять на рост и выживаемость Eucalyptus pellita и Acacia crassicarpa. В экспериментах выжило только 25 % неинокулированных контрольных растений E. рellita, тогда как выживаемость инокулированных растений была в 2–3 раза выше и составила 41,67–83,33 % [11, с. 026]. В отличие от E. pellita, выживаемость проростков A. crassicarpa была довольно высокой на протяжении всех обработок, в диапазоне от 83,33 до 100 %.

A. Sgueglia с соавторами показали, что растение Corylus avellana L.- лещина обыкновенная (семейство Betulaceae) очень сложно культивировать из-за высокой контаминации, при этом методы обеззараживания не во всех случаях гарантируют получение жизнеспособных эксплантов [12, с. 721]. В данном исследовании авторы сравнили время оббеззараживания гипохлоритом натрия и мертиолатом натрия (35 и 40 минут). 40-минутная обработка гипохлоритом натрия снижала загрязнение эксплантов у всех сортов, однако вызывала высокую частоту некроза у сортов «Каррелло» (50 %) и «Паноттара» (46,7 %). Наибольшая выживаемость побегов была получена при 40-минутной обработке (и гипохлоритом, и мертиолатом натрия) сортов «Миннулара» (26,7 %) и «Гирара» (20 %), тогда как обработка в течение 35-минут была более эффективной для «Каррелло» (33,3 %) и «Паноттара» (23,3 %) [12, с. 723].

Ответственным этапом микроразмножения является заключительный этап закрепления саженцев в почве и их закалки, требующие экономических затрат. На этом этапе количество побегов адаптированных к нестерильным условиям может составлять менее 50 %. Обработка проростков водными дисперсиями препаратов оксида графена (GO-Ag и GO-CuO) в концентрации 3 мкг/л показала лучшие результаты по сравнению с 4,5 мкг/л, так как повышенные концентрации наночастиц оказывают токсическое действие [13, с. 036]. При обработке 3 мкг/л GO-CuO и GO-Ag корневых микроклонов и листвы гибрида тополя белого, осины, березы, ивы трещинной и сосны обыкновенной число выживших проростков составило 70–100 %, превысив контроль на 10–32 %. Состояние проростков при этом достигло максимума 5 баллов, 60–70 % из которых были полностью адаптированы к новым условиям. После обработки препаратами 3 мкг/л GO-CuO и GO-Ag фотосинтетическая активность гибридов тополя белого, осины, березы, ивы трещинной и сосны обыкновенной повысилась более чем в 2 раза по сравнению с контролем, а также увеличилась резистентность проростков. В целом, обработка микроклонов малыми концентрациями наночастиц повышает адаптационные свойства проростков.

Таким образом, микроклональное размножение в in vitro условиях является одним из эффективных методов для восстановления генетического фонда растений. Территория Западного Казахстана представлена в основном полупустынными и степными массивами, однако на берегах рек можно встретить лесные и лесостепные полосы. Здесь в ограниченном пространстве бассейнов крупных водоемов произрастают редкие эндемичные виды древесно-кустарниковых. На сегодняшний день ученые используют метод in vitro культивирования для сохранения и приумножения растений занесенных в Красную книгу РК для озеленения городов и населенных пунктов.

Литература:

1. Мендыбаев Е. Х. Характеристика флоры степной зоны Западно-Казахстанской области // ВЕСТНИК Карагандинского университета. — 2010. — С. 28–30.
2. Дарбаева T. E. Исторический анализ флоры пойменных лесов бассейна реки Урал в пределах Западно-Казахстанской области //Вестник КазНУ. Серия биологическая. — 2016. — Т. 69. — №. 4. — С. 32–40.
3. Nunes S. et al. Efficient protocol for in vitro mass micropropagation of slash pine //In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. — 2018. — Т. 54. — №. 2. — С. 175–183.
4. Kuusienė S., Žiauka J. Somatic Embryogenesis in Micropropagation System of Hybrid Aspen (P. tremuloides× P. tremula) //Step Wise Protocols for Somatic Embryogenesis of Important Woody Plants. — Springer, Cham, 2018. — С. 181–188.
5. San José M. C. et al. Biotechnological efforts for the propagation of Quercus lusitanica Lam., an endangered species //Trees. — 2017. — Т. 31. — №. 5. — С. 1571–1581.
6. Regueira M. et al. Micropropagation of axillary shoots of Salix viminalis using a temporary immersion system //Trees. — 2018. — Т. 32. — №. 1. — С. 61–71.
7. Gatti E. et al. The effect of PlantformTM bioreactor on micropropagation of Quercus robur in comparison to a conventional in vitro culture system on gelled medium, and assessment of the microenvironment influence on leaf structure //Plant Biosystems-An International Journal Dealing with all Aspects of Plant Biology. — 2017. — Т. 151. — №. 6. — С. 1129–1136.
8. Ahmad A. et al. Gibberellic acid and thidiazuron promote micropropagation of an endangered woody tree (Pterocarpus marsupium Roxb.) using in vitro seedlings //Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). — 2021. — Т. 144. — №. 2. — С. 449–462.
9. Gailis A. et al. Silver birch (Betula pendula Roth.) culture initiation in vitro and genotype determined differences in micropropagation //New Forests. — 2021. — Т. 52. — №. 5. — С. 791–806.
10. Manokari M., Priyadharshini S., Shekhawat M. S. Micro-Structural stability of micropropagated plants of Vitex negundo L //Microscopy and Microanalysis. — 2021. — Т. 27. — №. 3. — С. 626–634.
11. Agustini L. et al. The effects of arbuscular mycorrhizal inoculation to growth and survivability of micropropagated Eucalyptus pellita and Acacia crassicarpa in nursery //IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. — IOP Publishing, 2020. — Т. 533. — №. 1. — С. 012028.
12. Sgueglia A. et al. Micropropagation of Sicilian cultivars with an aim to preserve genetic diversity in hazelnut (Corylus avellana L.) //Plant Biosystems-An International Journal Dealing with all Aspects of Plant Biology. — 2019. — Т. 153. — №. 5. — С. 720–724.
13. Zakharova O. et al. Influence of GO-Ag and GO-CuO composites on micropropagated shoots during adaptation to greenhouse environment //IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. — IOP Publishing, 2019. — Т. 693. — №. 1. — С. 012038.