Настоящая работа посвящена пополнению коллекции Ботанического сада имени Б. В. Гроздова (г. Брянск) некоторыми лекарственными видами растений, имеющих важную фармакологическую значимость. Были введены в культуру in vitro и методом клонального микроразмножения получены растения для дальнейшей адаптации, а также высадки в Ботаническом саду такие культуры как, алтей лекарственный, валериана лекарственная, базилик обыкновенный, иссоп лекарственный, розмарин лекарственный, цикорий обыкновенный.
Ключевые слова: культура in vitro, эффективность стерилизации, биоразнообразие, адаптация, лекарственные растения, ботанические сады.
Проблема сохранения генофонда ценных лекарственных растений в настоящее время приобретает все большую актуальность ввиду стремительного сокращения ареалов распространения и исчезновения многих видов. В связи с этим особо важным является поддержание биоразнообразия редких и исчезающих видов растений в естественных ареалах обитания ( in situ ), а также разработка перспективных методов сохранения ценного растительного материала в искусственных условиях ( ex situ ) [3]. В последнее время ботанические сады и дендрарии приобретают все большее значение в области охраны растительного мира: они превратились в важные центры сохранения биоразнообразия растений.
Создание заповедников, национальных парков, ботанических садов является традиционным способом сохранения биоразнообразия. Решением проблемы сохранения генофонда растений ex situ может выступать применение технологии культуры клеток и тканей in vitro (культуры меристем, тканей сеянцев в условиях замедленного роста), которая в течение последних лет интенсивно развивается и широко используется для решения фундаментальных и прикладных задач в биологии. Благодаря очевидным преимуществам работы c растительными объектами in vitro в контролируемых условиях вне организма этот метод используется для огромного количества видов. Так, при использовании небольшого количества ценного растительного материала и без нарушения естественных популяций может обеспечиваться сохранность генетического разнообразия видов на высоком уровне [1, 6].
Материалы и методы
В таблице 1 представлены семена лекарственных растений, которые были введены в стерильную культуру in vitro (семена компании «Гавриш»).
Таблица 1
Используемый в работе растительный материал
|
№ |
Название растения |
|
1 |
Алтей лекарственный ( Althaea officinalis L.), сорт Целитель |
|
2 |
Базилик обыкновенный ( Ocimum basilicum L.), сорт Зеленый ароматный |
|
3 |
Валериана лекарственная ( Valeriana officinalis L.), сорт Спокойный сон |
|
4 |
Иссоп лекарственный ( Hyssopus officinalis L.), сорт Лекарь |
|
5 |
Розмарин лекарственный ( Salvia rosmarinus L.), сорт Бирюса |
|
6 |
Цикорий обыкновенный ( Cichorium intybus L.), сорт Знахарь |
|
7 |
Лиственница сибирская ( Larix sibirica ), сорт Бригантина |
Стерилизацию эксплантов (в данном случае были использованы семена) проводили в растворе белизны (изготовитель ООО «ПЭТ-ФОРМ») в отношении с водой 1:2, время экспозиции составляло 5 минут с целью избавления от внешней бактериальной или грибной инфекции (рис. 9). Стерилизующий агент содержит активный хлор. Данный протокол был выбран как наиболее распространенный среди других научных групп по исследованию стерилизации эксплантов. Культивирование стерильных эксплантов (семян) осуществляли на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга (MS) без добавления фиторегуляторов роста [2, 4, 5].
Все работы по введению семян в культуру in vitro и дальнейшему микрочеренкованию велись в ламинар-боксе (БАВнп-01-«Ламинар-С».-1,2; изготовитель ЗАО «Ламинарные системы»), создающим стерильный воздух.
Культивировали экспланты, а также микрорастения при температуре 23±1 0 С, освещенности 4 тыс.люкс и фотопериоде 16 ч день/8 ч ночь, относительная влажность воздуха 60–70 %.
Этап микроразмножения растений осуществляли методом черенкования. Была осуществлена активация уже существующих в растении меристем (пазушных почек). Полученные таким образом побеги отделяли от первичного экспланта и культивировали на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков. Культивирование микрорастений после черенкования осуществляли на трёх видах питательной среды по прописи Мурасиге-Скуга (MS): с добавлением 6-БАП (6-бензиламинопурин) в концентрации 1 мг/л, с добавлением кинетина в концентрации 1 мг/л и контроль без фиторегуляторов роста.
Для этапа укоренения использовали безгормональную питательную среду Мурасиге-Скуга. Время культивирования в световой комнате 1 месяц.
Адаптацию растений из культуры in vitro проводили методом пересева в стерильный субстрат (торф и песок в пропорции 3:1). В течение двух недель после пересадки каждое растение находилось под пластиковым стаканчиком, обеспечивающим повышенную влажность, а также проводили периодическое опрыскивание водой из пульверизатора. После двух недель адаптации убирали пластиковые стаканчики с растений. По истечении трёх недель выращивания оценивали эффективность адаптации растений к лабораторным условиям по показателям приживаемости материала, так и по их биометрическим параметрам развития.
Результаты
Было простерилизовано 7 видов лекарственных растений. Через 20 дней культивирования оценивали эффективность стерилизации. Эффективность стерилизации оказалась достаточной для всех культур (100 %) кроме валерианы и лиственницы (60 % и 76 % соответственно).
Была замечена внешняя инфекция (валериана лекарственная 60 % эффективности стерилизации), вызванная загрязнением питательной среды во время стерилизации, это могло возникнуть по различным причинам (недостаточная чистота рук или инструментов). Внутренняя инфекция была обнаружена только у лиственницы сибирской (эффективность стерилизации 76 %), так как обрастания появились во время появления проростка. Для всех остальных культур эффективность стерилизации составила 100 %.
Наибольшую всхожесть показали семена алтея лекарственного и иссопа лекарственного (по 100 %). Базилик лекарственный, валериана лекарственная, цикорий лекарственный показали всхожесть 60 %, лиственница сибирская 80 %, розмарин лекарственный 20 % всхожести. Все взошедшие семена были использованы в дальнейшей работе.
После стерилизации семян, культивируемых на среде без фиторегуляторов роста, было решено перенести растения на три вида питательных сред для изучения их роста и развития, а также величину коэффициента размножения. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты культивирования растений на различных вариантах питательной среды с добавлением и без фиторегуляторов роста
|
Название растений |
Вариант питательной среды |
Исходное количество растений, шт. |
Количество растений через 1 месяц культивирования, шт. |
Количество обрастаний бактериями и грибной инфекцией через 2 месяца культивирования, шт. |
|
Алтей лекарственный |
Б/г 6-БАП (1 мг/л) Кинетин (1 мг/л) |
3 3 3 |
1 2 2 |
2 1 1 |
|
Базилик обыкновенный |
Б/г 6-БАП (1 мг/л) Кинетин |
3 3 3 |
3 3 3 |
0 0 0 |
|
Валериана лекарственная |
Б/г 6-БАП (1 мг/л) Кинетин |
2 2 2 |
2 2 2 |
0 0 0 |
|
Иссоп лекарственный |
Б/г 6-БАП (1 мг/л) Кинетин |
3 3 3 |
3 4 3 |
0 0 0 |
|
Лиственница сибирская |
Б/г 6-БАП (1 мг/л) Кинетин |
2 2 2 |
2 2 2 |
2 0 0 |
|
Цикорий обыкновенный |
Б/г 6-БАП (1 мг/л) Кинетин |
2 4 2 |
2 4 2 |
0 0 0 |
Анализируя полученные данные, можно сказать, что фиторегуляторы роста (6-БАП и кинетин) не смогли оказать значительного влияния на коэффициент размножения исследуемых культур. Лучший рост и развитие зеленой массы и корневой системы оказала среда без регуляторов роста, причин этому может быть несколько, например, время года введения в культуру (осень-зима), стерильность работы с культурой, количество растений (малая выборка для изучения роста и влияния регуляторов роста).
Оценка эффективности адаптации растений культуры in vitro к лабораторным условиям приведена в таблице 3.
Таблица 3
Эффективность адаптации микрорастений к лабораторным условиям
|
Название растений |
Исходное количество растений, шт. |
Количество растений через 1 месяц адаптации, шт. |
Процент адаптированных растений, % |
Число нормально развитых листьев, шт./растение |
Высота растений, среднее значение, см |
|
Алтей лекарственный |
2 |
1 |
50 |
8 |
27 |
|
Базилик обыкновенный |
9 |
0 |
0 |
- |
- |
|
Валериана лекарственная |
6 |
4 |
67 |
9,8 |
15 |
|
Иссоп лекарственный |
10 |
5 |
60 |
32 |
13 |
|
Цикорий обыкновенный |
8 |
1 |
13 |
8 |
4 |
Среди изучаемых культур наиболее приспособились к лабораторным условиям, учитывая количество и рост растений, валериана лекарственная и иссоп лекарственный. Данные культуры имеют хорошо развитые, плотные, кутинизированные листья, хорошо развитую коревую систему. Растениям лиственницы сибирской требуется больше времени для развития и формирования корневой системы, поэтому растения данной культуры мы не использовали для адаптации. Морфологические отличия до и после адаптации к лабораторным условиям приведены в таблице 4. После адаптации все растения были высажены в Ботаническим саду для дальнейшего наблюдения.
Таблица 4
Исследуемые растения до и после адаптации к лабораторным условиям
|
Название культуры |
Растения культуры in vitro до адаптации |
Растения культуры in vitro после адаптации |
|
Алтей лекарственный |
|
|
|
Валериана лекарственная |
|
|
|
Иссоп лекарственный |
|
|
|
Цикорий обыкновенный |
|
|
Выводы
- Проведен обзор научной литературы по выращиванию исследуемых культур методом in vitro . Было проанализировано, что самым распространенным методом стерилизации является использование белизны для удаления внешней инфекции с семенного материала. Данный метод был использован в настоящем исследовании.
- Были введены в культуру in vitro алтей лекарственный, базилик обыкновенный, валериана лекарственная, иссоп лекарственный, розмарин лекарственный, цикорий обыкновенный и лиственница сибирская. Эффективность стерилизации оказалась достаточной для всех культур кроме валерианы и лиственницы. Была обнаружена как внутренняя, так и внешняя инфекция в процесс введения в культуру in vitro лиственницы сибирской (76 %.) и валерианы лекарственной (60 %) соответственно. Наибольшую всхожесть показали семена алтея лекарственного и иссопа лекарственного по 100 %. Семена розмарина показали низкую всхожесть, поэтому в дальнейших экспериментах не использовались.
- Были адаптированы выращиваемые микрорастения культуры in vitro к лабораторным условиям. Наилучшим образом адаптировались такие культуры как алтей лекарственный (50 %), валериана лекарственная (67 %), иссоп лекарственный (60 %), цикорий обыкновенный (13 %). Растениям лиственницы сибирской требуется больше времени для развития и формирования корневой системы,
- поэтому растения данной культуры мы не использовали для адаптации.
Литература:
- Белошапкина О. О. Биологические и технологические основы оздоровления посадочного материала земляники от вирусов М.: МСХА. — 2005. 162с.
- Князькина М. С., Денисенко Л. М., Заякин В. В., Айтжанова С. Д., Нам И. Я. Получение сортового посадочного материала земляники садовой методом клонального микроразмножения in vitro // Вестник БГУ. 2011. № 4. [Электронный ресурс] URL: https://cyberleninka.ru/article/n/poluchenie-sortovogo-posadochnogo-materiala-zemlyaniki-sadovoy-metodom-klonalnogo-mikrorazmnozheniya-in-vitro (дата обращения: 13.02.2023).
- Леонова Н. В. Оптимизация состава питательной среды при размножении земляники садовой in vitro // Вестник Брянской государственной сельскохозяйственной академии. 2013. № 1. С. 45–48.
- Мацнева О. В., Ташматова Л. В. Оптимизация сроков введения земляники в культуру in vitro. 2018 год. [Электронный ресурс] URL: https://cyberleninka.ru/article/n/optimizatsiya-srokov-vvedeniya-zemlyaniki-v-kulturu-invitro/viewer (дата обращения 13.02.2023).
- Сковородников Д. Н., Леонова Н. В., Андронова Н. В. Влияние состава питательной среды на эффективность размножения земляники садовой in vitro // Вестник ОрелГАУ. 2013. № 1. [Электронный ресурс] URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vliyanie-sostava-pitatelnoy-sredy-na-effektivnost-razmnozheniya-zemlyaniki-sadovoy-in-vitro (дата обращения: 13.02.2023).
- Широков А. И., Крюков Л. А. Учебно-методический комплекс по дисциплине «Ботаника». Основы биотехнологии растений. 2012 год Электронное учебно-методическое пособие. [Электронный ресурс] URL: http://www.unn.ru/pages/eibrary/methodmaterial/files/Metod_Shirokov_Kryukov.pdf (дата обращения 13.02.2023).
